李雷，蘆銀華，姜衛(wèi)紅

中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所 合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

2000年，以生物振蕩器 (Synthetic oscillator)[1]和撥動(dòng)開關(guān) (Toggle switch)[2]為代表的人造功能器件的創(chuàng)造，宣告合成生物學(xué)作為一門新學(xué)科的正式誕生[3-4]。十年后，J.Craig Venter實(shí)驗(yàn)室完成了蕈狀支原體Mycoplasma mycoides“Synthia”的人工構(gòu)建[5]，合成生物學(xué)研究再次掀起了新的熱潮[6]。事實(shí)上，人造生命得以成功產(chǎn)生，主要得益于DNA大片段組裝方法的突破。近幾年來，利用大腸桿菌、酵母與芽胞桿菌等菌種的高效同源重組能力，各種體內(nèi)DNA多片段、大尺度的組裝方法相繼被開發(fā)，其代表有DNA裝配器[7]、“Inchworm method”[8]等。同時(shí)，為解決體外獲取DNA大片段的局限性，以非典型酶切連接或序列非依賴的chew-back組裝作為新理念，各種靈巧的體外組裝方法也應(yīng)運(yùn)而生，常見有 BiobrickBglbrick[9-10]、SLIC[11]與 Gibson 等溫一步法[12]等。這些體內(nèi)、體外DNA組裝方法的相繼誕生，加速了合成生物學(xué)功能元件庫[13]、生物合成途徑[7]乃至酵母染色體[14]的人工構(gòu)建，促進(jìn)了代謝工程[15]、基因組編輯[16-17]、誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞[18]等領(lǐng)域的迅速發(fā)展。

為了更詳細(xì)地闡述這些最新進(jìn)展，本文基于DNA組裝基本理念，綜述了近幾年來不同尺度DNA組裝新方法，以期為不同類型的合成生物學(xué)功能器件以及生物合成途徑的構(gòu)建提供有效的操作工具。

1 同源重組依賴的體內(nèi)DNA大片段組裝

同源重組 (Homologous recombination)是指含有同源序列的DNA分子之間或分子內(nèi)部的重新組合，其原理已廣泛應(yīng)用于基因克隆、定點(diǎn)突變和基因敲除等分子生物學(xué)研究。當(dāng)操作的DNA分子超過100 kb時(shí)，DNA體外組裝會(huì)十分困難，同源重組的優(yōu)勢將變得更加突出?，F(xiàn)在已被開發(fā)用于體內(nèi)大片段DNA組裝的菌種有：大腸桿菌、釀酒酵母與枯草芽胞桿菌等。這些菌種DNA重組能力的再開發(fā)，為后期進(jìn)行真核生物染色體與大尺度基因合成環(huán)路 (如光合作用系統(tǒng)、生物固氮系統(tǒng)或神經(jīng)環(huán)路等)的構(gòu)建奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[14,19]。

不過，任何方法都不是萬能的，體內(nèi)重組也存在一些問題，比如酵母可能對(duì)大腸桿菌復(fù)制子進(jìn)行修飾，導(dǎo)致組裝后的載體無法工作；又如當(dāng)組裝片段存在較高同源性時(shí)，可能引發(fā)不正確的組裝。因此，在方法的選擇與使用上，還需要仔細(xì)考量。下面將重點(diǎn)介紹幾種酵母及枯草芽胞桿菌體內(nèi)的大片段DNA拼接方法。

1.1 酵母介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化耦聯(lián)重組

作為一種模式生物，釀酒酵母是第一個(gè)完成測序的真核生物[20]。由于高效的DNA同源重組能力和操作的簡便性，由Larionov等提出的酵母轉(zhuǎn)化耦聯(lián)重組 (Transformation-associated recombination,TAR)理念已發(fā)展為多種DNA體內(nèi)拼接方法[21]，實(shí)現(xiàn)了啟動(dòng)子庫、目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑甚至小尺度基因組 (如線粒體、葉綠體基因組)的快速構(gòu)建[19]。

1.1.1 Gibson體內(nèi)一步組裝法

2008年，Science雜志報(bào)道了Gibson及其同事人工構(gòu)建生殖道支原體Mycoplasma genitalium基因組 (全長580 kb)的突破性進(jìn)展[22]。他們首先采用自創(chuàng)的體外變溫兩步組裝法 (后改進(jìn)為Gibson等溫一步法[12]，詳見下文)，獲得了支原體1/4基因組，但無法實(shí)現(xiàn)更大片段的組裝。不過，后來采用等溫一步法成功組裝了生殖道支原體的完整基因組，所以該研究中提及的、大片段DNA(＞200 kb)在大腸桿菌中的不穩(wěn)定性及細(xì)菌人工染色體攜載能力限制的原因，實(shí)際上并不成立。

回過來講，當(dāng)時(shí)在未改進(jìn)體外組裝方法時(shí)，是怎么實(shí)現(xiàn)完整基因組的拼接呢？按照上述作者提及的“主要原因”，就不得不更換宿主和載體。已知酵母人工染色體 (YAC)最大能攜載2 Mb的DNA分子，以及現(xiàn)存已成熟的轉(zhuǎn)化耦聯(lián)重組理念，作者轉(zhuǎn)向了酵母的體內(nèi)拼接。

如圖1所示，作者將BAC與YAC的功能元件都整合到pTARBAC3載體上，與另外5個(gè)DNA片段一并轉(zhuǎn)入釀酒酵母以實(shí)現(xiàn)組裝 (片段重疊區(qū)60～260 bp不等)。通過后續(xù)的脈沖場電泳鑒定與堿基錯(cuò)誤糾正 (詳見下文“堿基錯(cuò)誤控制”一欄)，實(shí)現(xiàn)了整個(gè)生殖道支原體基因組的正確組裝。事實(shí)上，2010年人造生命“Synthia”的誕生，就是在這樣的基礎(chǔ)上，組合人工細(xì)胞膜，演繹了上帝的角色。

后來，Gibson又在酵母中一次性組裝了38個(gè)寡核苷酸序列 (片段重疊區(qū) 20～200 bp不等)[23]，充分展現(xiàn)了酵母組裝多片段DNA的潛能，為后續(xù)藍(lán)藻Synechococcus elongatus染色體片段的組裝 (最大至450 kb)做好了準(zhǔn)備[24]。同年，趙惠民研究組也開發(fā)出類似的酵母體內(nèi)組裝方法——DNA裝配器 (DNA assembler)，并成功應(yīng)用于D-木糖代謝途徑 (9 kb)、玉米黃質(zhì)生物合成途徑 (11 kb)以及兩者的組合途徑 (19 kb)的快速組裝[25]，使天然產(chǎn)物的組合生物合成研究變得更為簡便、高效，加快了廉價(jià)原料利用和高價(jià)值目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)。

圖1 用于酵母體內(nèi)基因組水平DNA組裝的載體(pTARBAC3)Fig.1 The vector used for DNA assembly at the genome-scale in yeast contains both BAC(shown in orange)and YAC(shown in green)functional elements.The “hooks” are added to the pTARBAC3 vector by PCR.

1.1.2 內(nèi)切酶誘導(dǎo)的迭代拼接

多基因環(huán)路的組裝，首先想到的方式是逐級(jí)(Step-by-step)添加。雖然操作較為繁瑣，但方法穩(wěn)定，尤其當(dāng)組裝片段之間存在較高同源性時(shí)，上述提及的多片段體內(nèi)拼接，有可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的組裝。2011年，Laura等在酵母體內(nèi)開發(fā)了一種體內(nèi)迭代拼接法[26]，較好實(shí)現(xiàn)了逐級(jí)添加組裝多基因環(huán)路的理念。

作者通過兩套不同內(nèi)切酶與選擇標(biāo)記 (如HO/LacZ與SceI/HIS3)的交叉使用，可將多個(gè)基因逐步添加到酵母染色體上，實(shí)現(xiàn)了番茄紅素生物合成途徑的組裝。由于導(dǎo)入的基因都是整合在酵母染色體上，因此原則上來說可以實(shí)現(xiàn)“無限”長度的DNA分子組裝，前提是酵母染色體能夠容納。

1.2 枯草芽胞桿菌介導(dǎo)的基因組大片段拼接

2005年，Itaya等采用 “inchworm method”(類似于酵母中發(fā)展的內(nèi)切酶誘導(dǎo)的迭代拼接)[8]，成功將集胞藻Synechocystis基因組 (3.5 Mb)導(dǎo)入到枯草芽胞桿菌中，構(gòu)建了1個(gè)7.7 Mb的集成基因組。然而，該方法需要100 kb以上的DNA片段作為模板，其應(yīng)用受到了限制。于是，作者相繼開發(fā)了一種 “Domino method”[19]，借助芽胞桿菌基因組載體 (BGM vector)，由小片段 (4～6 kb)出發(fā)，利用同源重組原理與逐級(jí)添加模式，成功構(gòu)建了小鼠線粒體基因組 (16.3 kb)和水稻葉綠體基因組 (134.5 kb)。但由于比較耗時(shí)，組裝過程需長的同源臂，目前還未得到普遍使用。

事實(shí)上，當(dāng)DNA分子超過100 kb后，DNA的提取與轉(zhuǎn)化等常規(guī)操作將變得十分困難。2010年，Itaya及其同事們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，含有大質(zhì)粒(大于100 kb)的大腸桿菌被噬菌體侵染后，其中的大質(zhì)粒仍能夠穩(wěn)定存在。當(dāng)直接混合大腸桿菌裂解液與芽胞桿菌感受態(tài)，可以將DNA大片段穩(wěn)定整合到芽胞桿菌的基因組上。這種利用天然轉(zhuǎn)化方式，實(shí)現(xiàn)DNA大片段直接克隆的模式，被 Itaya 稱之為 “culture mix method”[27]。

綜上，從幾 kb到上百kb組裝的 “Domino method”，以及上百kb直接克隆的 “Culture mix method”，最后到幾 Mb水平拼接的“Inchwormmethod”，Itaya在芽胞桿菌中建立了一套較為完善的不同尺度DNA組裝體系，其應(yīng)用值得期待。

2 不同尺度的DNA體外組裝新方法

DNA化學(xué)合成，作為組裝DNA分子的起點(diǎn)之一，目前普遍使用固相亞磷酰胺三酯合成法(Phosphoramidite chemistry)[28]。由于合成長度在100 bp之內(nèi)，該方法一般僅用于引物等寡核苷酸的合成。如果進(jìn)一步采用連接酶拼接法 (Ligase chain reaction，LCR)或聚合酶拼接法 (Polymerase cycling assembly，PCA)，可以實(shí)現(xiàn)完整基因的合成[29]。至于更大的DNA片段拼接，上述方法已無法勝任。最近幾年，各種尺度的DNA體外組裝新方法相繼產(chǎn)生，克服了傳統(tǒng)酶切連接的局限性，使得無論在組裝的DNA片段數(shù)目還是尺度上都變得更為高效。

雖然體外DNA組裝方法琳瑯滿目，但都是由DNA拼接的基本理念衍生而來，也即兩分子銜接思想 (DNA joining)與多片段組裝模式(Assembly organization)的巧妙組合[30]，那么這些方法具體是如何產(chǎn)生的呢？其次，隨著組裝尺度的增加，堿基突變率將逐級(jí)擴(kuò)大，又如何控制堿基突變，獲得具有生理功能的DNA產(chǎn)物呢？最后，哪些體外組裝方法操作更為簡便、通用呢？下面就針對(duì)這些問題進(jìn)行簡要闡述。

2.1 DNA組裝的基本理念

DNA組裝基本理念包括了兩分子銜接思想與多片段組裝模式。DNA分子的銜接，如同建造房屋時(shí)磚塊間的堆砌。不言而喻，狹義上的“分子水泥”即是DNA連接酶，而廣義上則是指創(chuàng)造兩分子間的重疊區(qū)，通過連接或聚合的思想(圖2)，實(shí)現(xiàn)分子間拼接。同時(shí)，為獲取DNA大片段，我們不得不將多個(gè)不同小片段加以組裝，這就涉及到多片段的組裝模式。

在上文體內(nèi)拼接時(shí)，我們已介紹了基于“逐級(jí)添加模式”的迭代拼接法與 “Domino method”，也涉及到了幾十個(gè)片段一次性拼接的Gibson體內(nèi)“一步組裝模式”。實(shí)際上，體外組裝通常還采用一種等級(jí)化 (Hierarchical)組裝模式 (圖2)，它使得多基因環(huán)路的構(gòu)建過程變得更為高效、快捷。通過將多片段組裝模式與兩分子銜接思想進(jìn)行組合，便產(chǎn)生了各種各樣的DNA體外組裝新方法，如基于連接思想與等級(jí)化模式的Gibson等溫一步法，環(huán)式聚合酶延伸克隆(Circular polymerase extension cloning，CPEC)則是聚合思想和一步組裝模式的產(chǎn)物[31]。為系統(tǒng)說明DNA組裝方法的產(chǎn)生方式，此處一并將基于重組思想的體內(nèi)拼接方法囊括進(jìn)來，總結(jié)于表1中。

2.2 堿基錯(cuò)誤的控制

當(dāng)構(gòu)建的DNA尺度很大時(shí)，堿基突變頻率將逐級(jí)增加，此時(shí)就不得不特殊對(duì)待。其實(shí)，在合成任何長度的DNA分子時(shí)，堿基突變都必須仔細(xì)考慮。雖然更大尺度DNA組裝的堿基錯(cuò)誤控制與一般基因合成大同小異，都必須經(jīng)過測序、篩選與修復(fù)的過程，但為了獲得具有預(yù)期功能的組裝產(chǎn)物，還需注意以下兩點(diǎn)：1)保證出發(fā)片段的準(zhǔn)確性：采用化學(xué)合成或最高保真性DNA聚合酶獲得出發(fā)片段；2)組裝過程中需對(duì)片段間連接處進(jìn)行測序鑒定。

2.3 DNA體外組裝的常見方法

2.3.1 序列依賴的非典型酶切連接

隨著組裝DNA片段大小或數(shù)目的增加，基于常規(guī)限制性內(nèi)切酶的分子克隆，將變得舉步維艱。于是人們開始尋找一些獨(dú)特的工具酶，包括同尾酶、識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)不一致的Ⅱ型限制性內(nèi)切酶等，以延伸序列依賴的DNA拼接模式的應(yīng)用，建立新的非典型酶切連接方法。

圖2 DNA組裝的基本理念 (左圖為兩分子銜接思想，A、B、C分別代表連接、聚合與重組；右圖為多片段組裝模式，a、b、c分別代表逐級(jí)添加、一次性拼接與等級(jí)化組裝)Fig.2 Fundamental concepts of DNA assembly.In general,two DNA molecules can be joined in one of three ways:ligation (A),polymerization (B)and recombination(C).Small DNA fragments assembled into larger fragments are achieved by three organizational schemes,including assembly in series(a),by hierarchy(b),or by pooling(c).

1)Golden gate cloning：有一種特殊的Ⅱ型限制性內(nèi)切酶 (ⅡS型酶，如BsaⅠ和AarⅠ)，能夠在其DNA識(shí)別處的相鄰位置進(jìn)行剪切。如果人為設(shè)計(jì)識(shí)別位點(diǎn)不同的相鄰序列，就可利用同種限制酶產(chǎn)生不同的粘性末端，從而一次組裝多個(gè)片段，克服傳統(tǒng)多片段組裝時(shí)限制酶種類的限制，而且還可進(jìn)行無縫連接。Engler等利用上述原理結(jié)合基因改組技術(shù) (Gene shuffling)，發(fā)展了 Golden gate shuffling 方法[32]，一次實(shí)現(xiàn)9個(gè)小片段與載體的拼接，構(gòu)建了理論上可達(dá)19 683種、不同的重組胰蛋白酶原基因，以篩選高效表達(dá)的胰蛋白酶突變體。同時(shí)，這種方法還可用于重復(fù)序列的組裝，如最近興起的一種強(qiáng)大的基因組編輯工具——轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子核酶 (Transcription activator-like effector nucleases，TALENs)，由于該蛋白的 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是由序列差異很小的多個(gè)模塊組成，當(dāng)進(jìn)行人工設(shè)計(jì)組裝時(shí)，Golden gate cloning正好滿足此要求[16,33]。雖然該方法也依賴于粘性末端，但由于可產(chǎn)生更長的重疊區(qū)，也可用于多基因環(huán)路的構(gòu)建。比如，陳威華等借助一種可識(shí)別甲基化序列——(m)CNNR(R=A或G)——的ⅡS型內(nèi)切酶MspJI，發(fā)展了一種MASTER(Methylation-assisted tailorable ends rational)DNA組裝方法，并利用該方法成功克隆了天藍(lán)色鏈霉菌放線紫紅素生物合成基因簇 (29 kb)[34]。

2)同尾酶依賴的BiobrickBglbrick：為了構(gòu)建可預(yù)測的人工生物系統(tǒng)，合成生物學(xué)的主要任務(wù)之一就是獲得標(biāo)準(zhǔn)化的生物元件 (Biobrick)。當(dāng)采用如易錯(cuò)PCR、DNA改組或化學(xué)隨機(jī)合成獲得的不同元件，包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、開放閱讀框和終止子等[3]，如何將其快速組建起來獲得所需的功能器件，除了上述提及的Golden gate cloning，還有一種依賴于同尾酶的BiobrickBglbrick 方法[9-10]。

同尾酶 (如BglⅡ和BamHⅠ、XbaⅠ和SpeⅠ等)是指一類識(shí)別DNA分子中不同核苷酸序列，但能產(chǎn)生相同粘性末端的限制性內(nèi)切酶。當(dāng)酶切后的兩片段相連時(shí)，原來的酶切位點(diǎn)將不復(fù)存在，也就不能被原有的限制酶所識(shí)別，達(dá)到“焊死”狀態(tài)。因此，該種方法僅利用一對(duì)同尾酶，就可以實(shí)現(xiàn)DNA片段的多次組裝。雖然Biobrick與Bglbrick兩種方法在連接處均會(huì)產(chǎn)生疤痕，但后者疤痕處翻譯后為甘氨酸與絲氨酸，對(duì)于融合蛋白表達(dá)無影響，所以推薦選用Bglbrick方法。

2.3.2 序列非依賴型的Chew-back組裝

在上述提及的非典型酶切連接中，由于限制性內(nèi)切酶一般只能產(chǎn)生不超過10個(gè)堿基的粘性末端 (重疊區(qū))，無法滿足更大片段 (幾十kb以上)的拼接。那么是否可以跳出限制酶的使用，利用DNA外切酶產(chǎn)生更長的突出末端呢？實(shí)際上，這就是所謂的Chew-back組裝。最早實(shí)現(xiàn)該理念的是連接酶非依賴型克隆 (Ligationindependent cloning,LIC)，在此基礎(chǔ)上又相繼發(fā)展了SLIC與Gibson等溫一步法等。

1)SLIC(Sequence and ligation-independent cloning)及其改進(jìn)版

LIC主要利用T4 DNA聚合酶獨(dú)特性能，在一種堿基存在的反應(yīng)中，能夠特定停在某一位置，產(chǎn)生獨(dú)特的互補(bǔ)末端，從而進(jìn)行片段間的銜接。但LIC只能組裝兩個(gè)片段 (載體與目標(biāo)基因)，為了一次組裝多個(gè)DNA分子，Li與Elledge開發(fā)了一種序列與連接酶非依賴型克隆[11]。這種方法主要不同點(diǎn)是利用T4 DNA聚合酶外切酶活性非特異的chew-back，產(chǎn)生不同的單鏈DNA末端。然后采用單鏈退火或RecA介導(dǎo)的體外重組，從而實(shí)現(xiàn)1次反應(yīng)拼接5個(gè)或10個(gè)片段。

SLIC方法雖然一次可組裝超過10個(gè)片段，但需要很長的DNA重疊區(qū)，如組裝4個(gè)片段需要至少40 bp長的重疊區(qū)。為了減少重疊區(qū)的DNA長度，降低引物合成費(fèi)用，Schmid-Burgk等利用等級(jí)化組裝模式，開發(fā)了1次只需20 bp重疊區(qū)的DNA組裝新方法，我們稱之為SLIC改進(jìn)版[18]。在該研究中，作者將非特異的單鏈末端設(shè)計(jì)為獨(dú)特的ID序列 (僅含3種堿基)，通過反復(fù)使用這些ID與上述介紹的特殊Ⅱ型限制酶，就可以實(shí)現(xiàn)多片段中等尺度DNA(小于100 kb)的等級(jí)化組裝。他們將這種方法利用于產(chǎn)生誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞 (iPS)的基因環(huán)路構(gòu)建，雖未進(jìn)行功能鑒定，但方法靈活簡便，應(yīng)用前景值得期待。后來，作者又巧妙地將SLIC改進(jìn)版用于上文提及的轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)子核酶(TALENs)的重構(gòu)，相比Golden gate cloning方法，組裝的數(shù)目與效率都有所提高，同時(shí)滿足了TALENs高通量建庫篩選的要求[17]。

綜上所述，等級(jí)化組裝模式很好規(guī)避了逐級(jí)添加的耗時(shí)耗力與一次性組裝可能不正確的拼接。事實(shí)上，最早采用這種模式的是Gibson組裝方法，如上文提到利用此方法成功體外構(gòu)建了生殖道支原體基因組 (580 kb)[22]，下面就重點(diǎn)介紹其中一種具有代表性的Gibson組裝方法——Gibson等溫一步法。

2)Gibson等溫一步法

雖然SLIC或改進(jìn)版僅使用了一種十分便宜的T4 DNA聚合酶，但只能進(jìn)行中等尺度的DNA組裝，而且連接處將產(chǎn)生疤痕。因此，我們十分推薦Gibson等開發(fā)的等溫一步法[12]，因?yàn)樵摲椒ú粌H可實(shí)現(xiàn)無縫拼接，而且組裝尺度也十分可觀，現(xiàn)成功組裝最大的DNA分子大小為1.08 Mb。Gibson等溫一步法依舊采用優(yōu)秀的等級(jí)化組裝模式，最大的不同是將T4 DNA聚合酶(同時(shí)具有外切酶與聚合酶活性)劃分為T5外切酶和Phusion聚合酶，同時(shí)添加了Taq連接酶。

如圖3，T5外切酶具有熱不穩(wěn)定性，在50℃孵育時(shí)將逐漸失活。通過反應(yīng)時(shí)間的控制，T5外切酶會(huì)切割DNA使其產(chǎn)生一定長度的3′單鏈末端，在Phusion聚合酶與Taq連接酶介導(dǎo)下進(jìn)行退火，可1次實(shí)現(xiàn)多個(gè)片段的拼接。然后采用NotⅠ酶切獲得一級(jí)組裝產(chǎn)物，從而可進(jìn)行下一級(jí)組裝。這樣操作的優(yōu)勢是避免了單鏈粘性末端只能含有3種堿基的特殊限制，成功實(shí)現(xiàn)了大尺度DNA分子的無痕拼接。

3 總結(jié)與展望

隨著合成生物學(xué)的快速發(fā)展，不同尺度的DNA組裝方法 (體內(nèi)或體外)都相繼誕生。雖然這些方法均有各自的優(yōu)點(diǎn)，但如何選擇最適合的方法，主要基于三點(diǎn)：一是組裝的DNA分子尺度，二是能否容忍DNA片段間連接處疤痕的存在，三是組裝序列的同源性程度。等級(jí)化組裝模式與酵母體內(nèi)一次性多片段組裝的能力，由于自身突出的優(yōu)勢，將是未來更優(yōu)秀的DNA組裝方法開發(fā)的基點(diǎn)。同時(shí)，作為合成生物學(xué)不可或缺的一部分，各種DNA組裝方法除在代謝工程中的廣泛應(yīng)用外，將在更多領(lǐng)域發(fā)揮作用，如正開展的酵母真核染色體構(gòu)建、癌癥治療等[38-39]。

圖3 Gibson等溫一步法 (左圖為兩DNA分子銜接方法，右圖為多片段組裝策略)Fig.3 Gibson one-step isothermal assembly method.Two DNA fragments can be seamlessly joined into a molecule due to the overlapping end in a one-step isothermal process,involving three enzymes,including T5 exonuclease,Phusion polymerase and Taq ligase.Four DNA fragments(F1-F4)are assembled simultaneously using the cloning vector(pCC1BAC)and can be recovered by digestion with NotⅠfor the next level assembly.

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