王建莉，王小元

1江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

2江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122

微生物基因組精簡優(yōu)化是構(gòu)建合成生物學(xué)底盤細(xì)胞的重要策略[1]。在特定環(huán)境下，維持細(xì)胞正常代謝所需的最少基因群形成了該微生物的最小基因組[2]。獲得最小基因組的方法主要有兩種[3]：一種是“自上而下”，從現(xiàn)有微生物基因組中刪除非必需基因；另一種是“自下而上”，用基本原料人工合成[4]。微生物基因組精簡即采用“自上而下”法獲得最小基因組。

微生物基因組精簡一般選用遺傳背景明晰的工業(yè)生產(chǎn)菌[5]，如大腸桿菌、惡臭假單胞菌、枯草芽胞桿菌、谷氨酸棒桿菌、阿維鏈霉菌和酵母菌等。大腸桿菌的基因組精簡比例已達(dá)38.9%[6]。精簡區(qū)域的確定和精簡策略的設(shè)計(jì)是微生物基因組精簡的關(guān)鍵。文中針對(duì)這些關(guān)鍵問題進(jìn)行分析討論，為各種微生物基因組精簡工作的開展提供參考。

1 微生物基因組必需基因

微生物必需基因是維持細(xì)胞生存所必需的，其突變通常具有致死性，因此對(duì)開發(fā)控制病原微生物的藥物靶點(diǎn)具有重要意義[7]。掌握必需基因信息是基因組精簡優(yōu)化的前提條件。目前已經(jīng)報(bào)道全基因組序列的微生物有4 325個(gè)，但其中必需基因信息被確定的只有20種 (表1)。微生物的必需基因一般通過培養(yǎng)基篩選確定。表1中除血鏈球菌Streptococcus sanguinisSK36和釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae采用基本培養(yǎng)基篩選外，其他均采用豐富培養(yǎng)基。微生物中必需基因比例一般隨著總基因數(shù)的增多而減少。生殖支原體Mycoplasma genitalium和流感嗜血桿菌Haemophilus influenzae的基因組較小，必需基因比例分別為 79%[8]和 40%[9]；銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa基因組較大，其必需基因比例僅為5.6%[10]。多數(shù)微生物必需基因比例分布在10%～20%。用不同突變方法、篩選條件及判斷標(biāo)準(zhǔn)得出的必需基因會(huì)有所差異。

必需基因在不同微生物中保守性很高。與親緣關(guān)系較近的鏈球菌相比，血鏈球菌的必需基因編碼的蛋白同源性為80%，而非必需基因編碼的蛋白同源性為59%[11]。大腸桿菌的303個(gè)必需基因中有282個(gè)在腸桿菌中普遍存在[12]，如在傷寒沙門氏菌Salmonella typhimurium、弗朗西斯菌Francisella novicida、不動(dòng)桿菌Acinetobacter baylyiADP1和銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosaPAO1 中分別存在 256 個(gè)[13]、126 個(gè)[14]、256個(gè)[15]和133個(gè)[16]。不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌有209個(gè)公共必需基因[10,15]。牙齦卟啉單胞菌Porphyromonas gingivalis有463個(gè)必需基因，其中364個(gè)基因與其他微生物必需基因有較高的同源性[17]。微生物基因組中不保守的必需基因往往與細(xì)胞獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的主要區(qū)別在于細(xì)胞膜壁結(jié)構(gòu)和組成成分，二者基因組中與膜壁相關(guān)的必需基因也存在較大差異[11]。病原性微生物中的致病相關(guān)基因往往是必需基因，例如沙門氏菌中的O-抗原合成基因rfaL[13,18]，弗朗西斯菌中也存在42個(gè)致病相關(guān)的必需基因[14]；金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusN315和新月柄桿菌Caulobacter crescentus分別有51個(gè)[19]和48個(gè)[20]特有的必需基因。

微生物必需基因的保守性與其所編碼蛋白在細(xì)胞中的作用密切相關(guān)。多數(shù)微生物的必需基因所編碼的蛋白與DNA復(fù)制、細(xì)胞增殖、能量代謝、脂類合成等有關(guān)。血鏈球菌中DNA轉(zhuǎn)

錄、蛋白質(zhì)合成或修飾、多糖代謝的相關(guān)基因中有50%～76%是必需基因[11]。幽門螺桿菌Helicobacter pylori中細(xì)胞分裂、蛋白合成、核酸代謝的相關(guān)基因中有25%～38%為必需基因[21]。谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum中核酸代謝、細(xì)胞自身功能、胞內(nèi)代謝反應(yīng)的相關(guān)基因中也有20%～35%為必需基因[28]。大腸桿菌中核酸代謝和蛋白合成的相關(guān)基因中必需基因比例分別占28%和48%[24]。探索微生物必需基因的分布規(guī)律可以更好地設(shè)計(jì)細(xì)胞代謝途徑[35]，為構(gòu)建合成生物學(xué)底盤細(xì)胞提供理論依據(jù)。

表1 各種微生物中必需基因數(shù)目及確定方法Table 1 Number of essential genes with methods to identify them in various microorganisms

確定微生物必需基因的常用方法主要有基因組序列比對(duì)法、全局轉(zhuǎn)座插入突變法、單基因敲除法和反義RNA干擾法4種[24,36]。

1.1 基因組序列比對(duì)法

基因組序列比對(duì)法通過計(jì)算比對(duì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的微生物基因組確定必需基因[36]。微生物基因組信息的日益更新為基因組序列比對(duì)提供了有利條件。通過比對(duì)生殖支原體 (G+)和流感嗜血桿菌 (G?)的基因組序列，256個(gè)必需基因被確定[36-37]。通過比較8個(gè)較小微生物基因組，得到了僅含206個(gè)必需基因的最小基因組模型[38]。基因組序列比較的范圍越廣，得出的必需基因越少，但其保守性越強(qiáng)。通過比較3種大腸桿菌CFT073、DEL933和MG1655的基因組序列得出2 996個(gè)公共基因[39]，而比較100個(gè)基因組則可得出63個(gè)保守基因[36]?；蚪M序列比對(duì)法可以在短時(shí)間內(nèi)分析多種微生物基因的保守性，快速推測必需基因，但并不能準(zhǔn)確確定某種微生物的全部必需基因。通過全基因組序列比對(duì)得出的最小基因組模型可能使微生物無法生存[40]，但對(duì)基因組精簡優(yōu)化有很大參考價(jià)值。

1.2 全局轉(zhuǎn)座插入突變法

全局轉(zhuǎn)座插入突變法通過在染色體上高密度、高通量、超飽和地插入轉(zhuǎn)座子使基因突變，同時(shí)結(jié)合基因組足跡法或基因組測序技術(shù)確定必需基因。轉(zhuǎn)座子 (Transposon，Tn)可隨機(jī)插入到基因組許多位點(diǎn)，轉(zhuǎn)座子類型和轉(zhuǎn)座子的插入密度、間隙、位置都會(huì)影響必需基因的確定。常用的轉(zhuǎn)座子Tn5和Tn7被誘導(dǎo)修飾后其鑒定準(zhǔn)確性可進(jìn)一步提高[41]。在沙門氏菌中，通過阿拉伯糖誘導(dǎo)修飾獲得轉(zhuǎn)座子TnAraOut，進(jìn)一步缺失必需基因使其表現(xiàn)出果聚糖依賴性[42]。在銅綠假單胞菌PAO1中，通過乳糖誘導(dǎo)修飾得到ISphoA/hah和ISlacZ/hah進(jìn)而鑒定必需基因[10,16]。對(duì)轉(zhuǎn)座子進(jìn)行位點(diǎn)修飾可以在鑒定必需基因后進(jìn)一步構(gòu)建敲除突變株。在MG1655中，先采用Ⅰ-SceⅠ位點(diǎn)修飾的轉(zhuǎn)座子 Tn-Kan-Ⅰ-SceⅠ鑒定必需基因，然后通過表達(dá)Ⅰ-SceⅠ酶獲得了非必需基因的突變菌株庫[43]。在弗朗西斯菌中，先采用FRT位點(diǎn)修飾的轉(zhuǎn)座子ISFn2/FRT鑒定必需基因，進(jìn)而表達(dá)Flp酶構(gòu)建缺失突變株檢驗(yàn)鑒定結(jié)果[14]。同時(shí)使用多種轉(zhuǎn)座子鑒定微生物的必需基因可提高準(zhǔn)確性，如在谷氨酸棒桿菌中應(yīng)用IS31831和Tn5[28]，在弗朗西斯菌中應(yīng)用T17(ISFn1)、T18(ISFn2) 和 T20(ISFn2/FRT)[14]。在空腸彎曲菌Campylobacter jejuni中，使用不同的體外轉(zhuǎn)座子Tn7和Mariner各得到625個(gè)和414個(gè)候選必需基因，其中233個(gè)共有基因被確定為必需基因[26]；Stahl和Stintzi采用EZ-Tn5-Cm轉(zhuǎn)座子確定出空腸彎曲菌195個(gè)必需基因[25]，但與前者僅重疊26個(gè)[26]。通常情況轉(zhuǎn)座子插入密度越大，間隙越小，插入位點(diǎn)越關(guān)鍵，結(jié)果越準(zhǔn)確。全局轉(zhuǎn)座插入突變法效率高，結(jié)果較為準(zhǔn)確，應(yīng)用較廣泛，幾乎所有的微生物都可以用全局轉(zhuǎn)座插入法來確定其必需基因。但是，該方法也會(huì)錯(cuò)誤地將不含轉(zhuǎn)座子的小基因確定為必需基因[10]，并容易將插入位置離3′端較近的基因[23]和同功酶編碼基因[11]確定為非必需基因。

1.3 單基因敲除法

單基因敲除法通過逐一突變失活單個(gè)基因后考察菌株能否生存來確定必需基因[12]。非必需基因失活突變株會(huì)被篩選得到，但必需基因失活具有致死性。在大腸桿菌BW25113中，通過FRT/Flp位點(diǎn)特異性重組敲除獲得了3 985個(gè)單突變株并進(jìn)一步確定出303個(gè)必需基因[12]。在不動(dòng)桿菌中通過同源重組敲除獲得2 594個(gè)突變株，進(jìn)而確定499個(gè)必需基因[15]。在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae中通過高通量敲除后考察突變株生長狀況，進(jìn)一步確定出1 105個(gè)必需基因[44]。不同方法確定的必需基因群會(huì)有差異。在大腸桿菌中，通過單基因敲除法[12]和通過全局轉(zhuǎn)座插入突變法[24]確定的必需基因群僅重疊205個(gè)。這種差異主要是突變手段、生長條件或判斷標(biāo)準(zhǔn)的不同所導(dǎo)致[12]。全局轉(zhuǎn)座插入突變法可能將導(dǎo)致生長緩慢的突變基因鑒定為必需基因，而單基因敲除法嚴(yán)格按照菌株能否生存來確定必需基因[12]。通過將必需基因回補(bǔ)到mini-F質(zhì)粒上使突變株表現(xiàn)回補(bǔ)依賴性也可以輔助鑒定必需基因，303個(gè)大腸桿菌必需基因中有35個(gè)并無回補(bǔ)依賴性[45]，這主要是由篩選條件的不同所導(dǎo)致的。結(jié)合全基因組序列比對(duì)法可以減少單基因敲除的工作量。例如在血鏈球菌中，先通過全基因組序列比對(duì)得出較為保守的基因群，再對(duì)這些保守基因進(jìn)行敲除來確定必需基因群[19]。雖然通過嚴(yán)格考察單個(gè)基因突變的致死性來確定必需基因很精確，但工作量很大，同時(shí)會(huì)錯(cuò)誤地將同工酶基因鑒定為非必需基因，也會(huì)由于敲除效率低或篩選不當(dāng)將非必需基因鑒定為必需基因。因此，該方法可以結(jié)合基因組序列比較法提高篩選通量，也可以結(jié)合基因回補(bǔ)方法提高鑒定準(zhǔn)確率。

1.4 反義RNA干擾法

反義RNA干擾法先通過反義RNA阻止某特定基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，再通過高效滴定法考察突變株的生長狀況，將致死性的基因確定為必需基因[31]。該方法目前應(yīng)用較少，只被應(yīng)用于金黃色葡萄球菌中，在菌株WCUH29和RN4220中分別確定了150個(gè)[30]和658個(gè)[31]必需基因。這種方法快捷，在臨床上有很好的應(yīng)用前景，但目前應(yīng)用有一定的局限性[30]。

2 微生物基因組精簡策略

微生物基因組精簡策略是構(gòu)建合成生物學(xué)底盤細(xì)胞的關(guān)鍵所在，基因組精簡主要基于同源重組 (Homologous recombination)、雙鏈斷裂修復(fù) (Double strains break repair，DSBR)重組、位點(diǎn)特異性重組 (Site-specific recombination)、轉(zhuǎn)座重組 (Transpositional recombination)及噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo) (Transduction)技術(shù)。其中，雙鏈斷裂修復(fù)重組和位點(diǎn)特異性重組均建立在同源重組的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)基因敲除。轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)通過噬菌體侵染細(xì)胞，可以將各菌株的大片段突變型整合入1個(gè)受體菌中，提高基因組精簡效率。同源重組和雙鏈斷裂修復(fù)重組可實(shí)現(xiàn)無痕敲除，而位點(diǎn)特異性重組和轉(zhuǎn)座重組會(huì)有堿基殘留。轉(zhuǎn)座重組一般可循環(huán)敲除獲得基因組精簡菌株，其余重組可通過重復(fù)敲除或轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得基因組精簡菌株。

2.1 基于同源重組的基因組精簡

同源重組是指兩個(gè)DNA分子之間同源區(qū)域交換實(shí)現(xiàn)序列重組的過程，并使得重組基因組穩(wěn)定遺傳。同源重組中的外源DNA包括環(huán)形質(zhì)粒和線性片段兩種。用于敲除的環(huán)形質(zhì)粒主要是指自殺質(zhì)粒，其敲除主要基于宿主菌自殺質(zhì)粒的同源交換，而使用線性片段敲除主要基于Red重組的同源交換。通過同源重組進(jìn)行基因組精簡時(shí)往往需要同時(shí)引入抗性篩選標(biāo)記 (Positive selection marker)和負(fù)篩選標(biāo)記 (Negative selection marker)。

2.1.1 基于自殺質(zhì)粒的同源重組

自殺質(zhì)粒 (Suicide plasmid)通常在宿主菌中不能復(fù)制，可通過其攜帶的同源臂重組整合到染色體上敲除目的基因 (圖1A)。質(zhì)粒重組包括同源單交換和雙交換：同源單交換在敲除過程中通過1個(gè)同源臂重組將整個(gè)質(zhì)粒整合到基因組上，而同源雙交換則通過2個(gè)同源臂重組替換目標(biāo)基因片段。基因組精簡時(shí)，可根據(jù)目標(biāo)片段大小及重組效率選擇合適的同源交換方式。在大腸桿菌中，自殺質(zhì)粒同源雙交換可以用于敲除中等長度片段[46]。在阿維鏈霉菌中，Komatsu等采用典型的自殺質(zhì)粒同源雙交換可一次性敲除1.48 Mbp的基因片段[47]。自殺質(zhì)粒同源重組敲除雖可廣泛地應(yīng)用于多種微生物，但反復(fù)構(gòu)建質(zhì)粒較為繁瑣，并需要較好地控制條件以減少假陽性轉(zhuǎn)化子。自殺質(zhì)粒同源雙交換中第二輪交換效率較低，且容易回復(fù)突變?yōu)橐吧捅硇?，不利于敲除突變株的篩選。

2.1.2 基于線性DNA片段的同源重組

線性DNA片段是含有目的基因同源臂的敲除片段，通過電轉(zhuǎn)化將敲除片段導(dǎo)入宿主菌中并與基因組發(fā)生同源重組，從而實(shí)現(xiàn)目的基因等位替換 (圖1B)。線性DNA片段的同源重組最早應(yīng)用于釀酒酵母中，通過在篩選標(biāo)記兩端添加40～50 bp的同源臂并PCR擴(kuò)增獲得敲除片段，將其電轉(zhuǎn)入酵母中發(fā)生同源重組，進(jìn)一步利用抗性標(biāo)記篩選敲除突變株[48]。在釀酒酵母和栗酒裂殖酵母中，通過線性DNA片段同源重組已獲得了一系列基因組精簡菌株[49-50]。但在大腸桿菌中，RecBCD核酸外切酶會(huì)降解外源線性DNA片段，從而阻止敲除片段和基因組的同源重組[51]。Datsenko和Wanner利用λ-Red噬菌體中能抑制RecBCD的酶Gam、核酸外切酶Exo和單鏈結(jié)合蛋白Bet構(gòu)建輔助質(zhì)粒pKD46，提高了外源線性片段DNA的重組效率[52]和質(zhì)粒同源重組效率[47]。線性片段同源重組在大腸桿菌的基因組精簡中應(yīng)用廣泛，獲得了許多基因組精簡菌株，例如Δ16、Δ33[6]、MGF-01 和 DGF298[53]。通過λ-Red同源重組可敲除較長的基因片段，兩輪同源重組后獲得無痕敲除突變株[46,54]，最后將不影響底盤細(xì)胞特性的突變基因通過P1轉(zhuǎn)導(dǎo)[55]整合，獲得最終基因組精簡菌株[46,54]。在枯草芽胞桿菌中，Morimoto等結(jié)合線性DNA同源重組和自殺質(zhì)粒兩輪同源重組進(jìn)行基因組精簡 (圖1C)，前者用于敲除目的區(qū)域，后者用于去除篩選標(biāo)記[56]。線性敲除片段的構(gòu)建較自殺質(zhì)粒更為簡捷，重組效率也較高。

在同源重組中，往往通過引入合適的負(fù)篩選標(biāo)記，并利用負(fù)篩選標(biāo)記表達(dá)菌株對(duì)特定物質(zhì)具有敏感性的特點(diǎn)，提高無痕敲除突變株的篩選效率。常用的負(fù)篩選標(biāo)記有SacB、RpsL、Upp、Ura3或Ura4。其中，蔗糖致死性基因sacB存在于枯草芽胞桿菌，編碼果聚糖蔗糖酶，在革蘭氏陰性菌中表達(dá)sacB后可將蔗糖轉(zhuǎn)化為果聚糖，堵塞在周質(zhì)空間而使菌體死亡[57]。鏈霉素致死性基因rpsL編碼的核糖體蛋白S12與鏈霉素形成復(fù)合物，增強(qiáng)了鏈霉素與細(xì)菌16S rRNA的結(jié)合能力從而阻止基因組轉(zhuǎn)錄[58]。5-氟尿嘧啶致死性基因upp編碼尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，可將細(xì)胞外源的5-氟尿嘧啶轉(zhuǎn)為細(xì)胞有毒物質(zhì)抑制細(xì)胞生長[59]。5-氟乳清酸 (5-FOA)致死性基因pyrF或ura3和ura4編碼乳清苷酸脫羧酶，可以催化5-氟乳清酸轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì)使細(xì)胞死亡[60]。在大腸桿菌中，常用SacB作為第二輪篩選標(biāo)記，其篩選準(zhǔn)確率平均達(dá)93%[61]，敲除rpsL基因后，也可以選用RpsL作負(fù)篩選標(biāo)記[6]。通過串聯(lián)sacB和rpsL實(shí)現(xiàn)雙重負(fù)篩選可進(jìn)一步提高篩選準(zhǔn)確率[46]。在谷氨酸棒桿菌中，引入sacB后通過質(zhì)粒雙輪同源交換也可以實(shí)現(xiàn)多輪無痕敲除[62]。在枯草芽胞桿菌中，通過先敲除或突變upp基因后再引入U(xiǎn)pp作負(fù)篩選標(biāo)記實(shí)現(xiàn)多輪敲除[56]。在酵母中，常用Ura3(或Ura4)作為基因組精簡中的負(fù)篩選標(biāo)記[49-50]。在栗酒裂殖酵母中，引入U(xiǎn)ra4后可以進(jìn)行多輪高效精確的無痕精簡[50,63]。負(fù)篩選標(biāo)記的引入有利于實(shí)現(xiàn)基因組的多輪無痕精簡，提高同源重組的篩選效率。

2.2 基于DSBR的基因組精簡

DSBR主要基于同源重組和基因組自修復(fù)機(jī)制實(shí)現(xiàn)基因敲除或基因組精簡。Posfai等在1999年提出該方法[64]，通過自殺質(zhì)粒同源單交換在基因組中引入Ⅰ-SceⅠ識(shí)別位點(diǎn)S(18 bp)，通過Ⅰ-SceⅠ酶表達(dá)從S點(diǎn)處中斷基因組，從而誘導(dǎo)胞內(nèi)SOS應(yīng)急系統(tǒng)并啟動(dòng)基因組自身修復(fù)機(jī)制，主要在RecA核酸酶輔助下同源重組，從而刪除篩選標(biāo)記[64]，達(dá)到無痕敲除。在大腸桿菌中，Kolisnychenko等通過DSBR重組進(jìn)行目的片段(6～82 kb)的無痕敲除 (圖1D)[65]，Posfai等也采用該策略最終獲得了一系列MDS(Multipledeletion series)精簡菌株[66]。所構(gòu)建的敲除片段含3段同源臂A、B和C，抗性篩選標(biāo)記和2個(gè)Ⅰ-SceⅠ識(shí)別位點(diǎn)S，其中A和B為目的敲除區(qū)域的兩端同源序列，C緊靠B為敲除區(qū)域末端的同源序列 (圖1D)。先通過A和C同源重組替換目的片段，同時(shí)引入2個(gè)Ⅰ-SceⅠ識(shí)別位點(diǎn)S，進(jìn)而通過B序列同源重組修復(fù)達(dá)到基因組無痕精簡[65-66]。通過引入負(fù)篩選標(biāo)記可提高DSBR敲除的篩選效率和準(zhǔn)確性[67-68]，Yu等在敲除盒中引入負(fù)篩選標(biāo)記和1個(gè)S位點(diǎn)即可實(shí)現(xiàn)高效敲除(圖1E)[68]，他們利用不同啟動(dòng)子將Ⅰ-SceⅠ酶整合到pKD46上，構(gòu)建兩輪重組一體化質(zhì)粒pRED1可進(jìn)一步改善敲除系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)快速高效的敲除[68]。DSBR敲除系統(tǒng)也可以應(yīng)用于惡臭假單胞菌[69]和谷氨酸棒桿菌[70]等微生物中。DSBR重組可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)高效的無痕敲除，但往往需通過多次重疊PCR獲得同源重組片段。

2.3 基于位點(diǎn)特異性重組的基因組精簡

位點(diǎn)特異性重組通過特異性酶識(shí)別相應(yīng)位點(diǎn)并刪除位點(diǎn)間基因片段。位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)主要有Flp/FRT[52]和Cre/loxP[71]兩種，它們常與同源重組結(jié)合應(yīng)用于多種微生物的基因敲除。Flp和Cre是位點(diǎn)特異性識(shí)別酶，分別識(shí)別特異性位點(diǎn)FRT和loxP。FRT和loxP均含有2個(gè)反向的13 bp序列，以及1個(gè)8 bp的中心區(qū)域。特異性酶識(shí)別同向的特異性位點(diǎn)并重組去除位點(diǎn)之間的DNA序列。

Flp/FRT敲除系統(tǒng)多用于大腸桿菌、惡臭假單胞菌和酵母的基因敲除或基因組精簡[72]。Cre/loxP較Flp/FRT系統(tǒng)應(yīng)用更廣泛，可應(yīng)用于多種微生物的基因組精簡。當(dāng)敲除的目標(biāo)片段較短時(shí)，只需合成1個(gè)敲除載體或片段，攜帶2個(gè)loxP位點(diǎn)，先通過同源重組替換目的基因，再通過Cre酶識(shí)別loxP位點(diǎn)重組去除篩選標(biāo)記[73]。當(dāng)敲除目標(biāo)片段過長時(shí)，可分別構(gòu)建兩端基因的敲除載體或片段，各帶1個(gè)loxP位點(diǎn)，先通過同源重組將loxP位點(diǎn)引入到目的區(qū)域兩端，再通過Cre酶刪除目的基因片段及篩選標(biāo)記。在大腸桿菌中，F(xiàn)ukiya等通過敲除片段在目的區(qū)域兩端各引入1個(gè)loxP位點(diǎn) (圖1F)，可以敲除長達(dá)117 kb的片段[74]，但其上游loxP位點(diǎn)位于抗性標(biāo)記右側(cè)，最終上游抗性標(biāo)記未去除。在阿維鏈霉菌中，Komatsu等采用類似的原理，通過2個(gè)敲除載體分別引入loxP位點(diǎn)，可敲除1.51 Mbp的片段[47]，其loxP均位于篩選標(biāo)記和同源臂之間，最終可以去除篩選標(biāo)記。Cre/loxP重組在每一輪敲除后會(huì)殘留1個(gè)位點(diǎn)，干擾下一輪位點(diǎn)特異性識(shí)別。為了避免這種干擾，可設(shè)計(jì)攜帶突變序列的特異性位點(diǎn)，重組后序列發(fā)生突變，不再被Cre酶識(shí)別，進(jìn)而可實(shí)現(xiàn)連續(xù)敲除。在谷氨酸棒桿菌中，Suzuki等通過設(shè)計(jì)帶有突變位點(diǎn)的loxP-LE和loxP-RE建立Cre/lox突變系統(tǒng) (圖1G)，可連續(xù)進(jìn)行11輪敲除，每輪敲除的冗余片段長10～56 kb[75]。位點(diǎn)特異性重組較單一的同源重組敲除效率更高，無需引入負(fù)篩選標(biāo)記，操作方便，廣泛應(yīng)用于多種微生物的基因敲除和基因組精簡；但敲除后會(huì)殘留特異性位點(diǎn)，不利于實(shí)現(xiàn)基因組無痕精簡。

2.4 基于轉(zhuǎn)座重組的基因組精簡

基因轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座酶的催化下可隨機(jī)插入到基因組許多位點(diǎn)。復(fù)合式轉(zhuǎn)座子不僅含轉(zhuǎn)座酶(Transposase)基因，而且?guī)в衅渌剐曰蚧蛩拗骰?，兩端往往有重?fù)序列。轉(zhuǎn)座酶與轉(zhuǎn)座子兩端及DNA靶序列結(jié)合后將雙鏈DNA交錯(cuò)切割，同時(shí)在轉(zhuǎn)座子雙鏈的兩端切斷不同單鏈，使產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座子游離端和靶序列游離端連接。利用復(fù)合式轉(zhuǎn)座子的特點(diǎn)，可以將其應(yīng)用于微生物基因組精簡。在大腸桿菌中，Goryshin等利用Tn5轉(zhuǎn)座子建立了以轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的基因組精簡策略(圖1H)，最終成功精簡基因組5.6%，獲得菌株Δ20-4[76]。Tn5轉(zhuǎn)座子由核心序列和兩條倒置的IS50序列組成。核心序列中的轉(zhuǎn)座基因表達(dá)轉(zhuǎn)座酶Tnp-EK/LP，抗性基因供轉(zhuǎn)座突變株篩選。IS50具有19 bp的倒置末端，外末端OE和內(nèi)末端IE，其中OE介導(dǎo)整個(gè)轉(zhuǎn)座子插入基因組，IE是轉(zhuǎn)座酶Tnp-EK/LP的作用位點(diǎn)。當(dāng)Tn5隨機(jī)插入到大腸桿菌基因組上，表達(dá)轉(zhuǎn)座酶Tnp-EK/LP結(jié)合到2個(gè)IE序列上，從該處單鏈切斷使其產(chǎn)生粘性末端，同時(shí)刪除核心序列。此時(shí)，有活性的轉(zhuǎn)座酶Tnp-EK/LP使得2個(gè)IE序列在基因組內(nèi)部轉(zhuǎn)位，并使插入位置的DNA形成2個(gè)游離端。當(dāng)左邊IE的粘性末端與右邊的游離端連接時(shí)實(shí)現(xiàn)基因片段 (4～23 kb)敲除 (圖1H)，而右邊IE與左邊游離端連接形成回補(bǔ)質(zhì)粒[76]?；谵D(zhuǎn)座酶重組的基因組精簡可以篩選得到較多敲除突變株，效率較高，同時(shí)可以進(jìn)行基因功能研究；但會(huì)在基因組上殘留若干對(duì)端部序列，且隨機(jī)性過強(qiáng)，不易準(zhǔn)確控制精簡區(qū)域，還需通過全基因組測序來鑒定敲除區(qū)域。

2.5 基于多種敲除系統(tǒng)復(fù)合的基因組精簡

利用各敲除系統(tǒng)的典型特點(diǎn)，綜合多種敲除系統(tǒng)可建立更為理想和高效的基因組精簡策略。在谷氨酸棒桿菌中，Suzuki等結(jié)合Cre/loxP和DSBR敲除系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了連續(xù)無痕敲除 (圖2A)[70]。構(gòu)建兩個(gè)自殺質(zhì)粒，通過其同源雙交換在目的區(qū)域的兩端同時(shí)引入loxP位點(diǎn)和Ⅰ-SceⅠ識(shí)別位點(diǎn)S。其中l(wèi)oxP位點(diǎn)處于抗性篩選標(biāo)記和負(fù)篩選標(biāo)記間，而S位點(diǎn)處于同源臂和負(fù)篩選標(biāo)記之間。先通過Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組刪除目的片段，再通過DSBR重組去除篩選標(biāo)記及l(fā)oxP位點(diǎn)，獲得無痕敲除菌株[70]。Cre/loxP和DSBR敲除系統(tǒng)的有序結(jié)合實(shí)現(xiàn)了高效的連續(xù)無痕精簡。

在惡臭假單胞菌中，Leprince等通過結(jié)合轉(zhuǎn)座重組和位點(diǎn)特異性重組建立了一套基于Tn5和FRT/Flp的基因組精簡策略 (圖2B)[72]。通過對(duì)Tn5衍生的小型轉(zhuǎn)座子進(jìn)行單個(gè)FRT位點(diǎn)修飾，形成兩種帶有不同篩選標(biāo)記的小型轉(zhuǎn)座子Mini-Tn5KpF和Mini-Tn5TF，分別含有1個(gè)OE和IE，F(xiàn)RT位點(diǎn)緊靠OE序列。前者使突變株具有Km抗性和基因pyrF引起的5-FOA敏感性，后者使菌株具有亞碲酸鉀 (Tel)抗性。首先通過Mini-Tn5KpF的隨機(jī)插入到惡臭假單胞菌基因組中獲得單插入突變株庫SMT(63株)。再從中隨機(jī)選擇9株，插入Mini-Tn5TF轉(zhuǎn)座子，獲得雙插入突變株庫TMT(573株)。通過測序確定TMT菌株的突變情況，篩選合適的突變株 (7株)，其FRT位點(diǎn)同向，Mini-Tn5KpF和Mini-Tn5TF分別在所敲除區(qū)域上游和下游。通過Flp酶識(shí)別FRT位點(diǎn)重組，去除非必需片段和抗性篩選標(biāo)記，獲得精簡菌株 91-Δ1和 407-Δ1[72]。在Δ1菌株中同時(shí)插入 Mini-Tn5KpF和Mini-Tn5TF獲得Δ1SMT突變株庫，進(jìn)一步通過三親雜交整合兩種轉(zhuǎn)座的突變型，獲得多種Δ1TMT菌株。Δ1TMT包括兩種轉(zhuǎn)座子，3個(gè)FRT位點(diǎn)，表達(dá)Flp酶后有多種重組情況 (圖2B)，均可以繼續(xù)精簡獲得91-Δ2和 407-Δ2，精簡比例最高為7.4%[72]。該敲除策略可以快速實(shí)現(xiàn)較長區(qū)域的敲除，所構(gòu)建的突變株庫可以進(jìn)行基因功能研究；但該策略隨機(jī)性強(qiáng)，最終在基因組上殘留FRT位點(diǎn)，甚至殘留抗性標(biāo)記和轉(zhuǎn)座子序列。

在大腸桿菌中，Yu等通過結(jié)合轉(zhuǎn)座重組、位點(diǎn)特異性重組及P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了基因組精簡 (圖 2C)[77]。通過對(duì)Tn5轉(zhuǎn)座子進(jìn)行單個(gè)loxP位點(diǎn)修飾得到TnKloxP(Kanr)和TnCloxP(Cmr)轉(zhuǎn)座子，分別在基因組中隨機(jī)插入構(gòu)建突變株庫，并確定各突變株插入位置。根據(jù)目的敲除區(qū)域，從兩種突變株庫中分別選擇相應(yīng)的突變株，其loxP位點(diǎn)同向并分別位于目的敲除區(qū)域兩端。先通過P1轉(zhuǎn)導(dǎo)整合突變基因，再誘導(dǎo)Cre酶識(shí)別loxP位點(diǎn)刪除目的片段 (59～117 kb)。重復(fù)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)和位點(diǎn)特異性重組可實(shí)現(xiàn)連續(xù)敲除，最終獲得精簡菌株 CDΔ3456，精簡比例達(dá)6.7%[77]。這種敲除策略通過轉(zhuǎn)座子高通量插入可以獲得較多突變株，結(jié)合P1轉(zhuǎn)導(dǎo)和Cre/loxP可以快速實(shí)現(xiàn)目的片段的敲除；但該策略有一定的隨機(jī)性，需通過基因組測序鑒定轉(zhuǎn)座突變基因，也會(huì)在基因組上殘留抗性標(biāo)記和loxP位點(diǎn)。

圖2 基于多種重組系統(tǒng)復(fù)合的微生物基因組精簡策略Fig.2 Microbial genome-reduction strategies by combining different recombination systems.(A)The combined strategies of the Cre/loxP system and DSBR.S and loxP sites are integrated into the chromosomes via homologous recombination of the plasmids[70].(B)The combined strategies of the transposon insertion and the FLP/FRT site-specific recombination.Two rounds of the deletions are shown[72].(C)The combined strategies of the Tn5 transposon,Cre/loxP excision system and P1 transduction.After insertions of two modified Tn5,the two mutant strains with a loxP site are combined into a single strain by P1 transduction[77].The target DNA between the two loxP sites in the new mutant strain is deleted by Cre recombination.The double oblique hyphens represent the break regions of the chromosomal DNA.The letters A and B represent the homologous arms of the target DNA on the chromosome.OE and IE represent external and internal transposon ends in Tn5,respectively.Pm and Nm represent positive and negative selection markers,respectively.

3 微生物基因組精簡現(xiàn)狀

通過基因組精簡優(yōu)化，微生物細(xì)胞的生產(chǎn)潛力和可控性會(huì)大幅度增強(qiáng)[78]，可以更有效地合成目的產(chǎn)物[79]。目前基因組精簡優(yōu)化的大腸桿菌、惡臭假單胞桿菌、枯草芽胞桿菌、谷氨酸棒桿菌、鏈霉菌及酵母菌均有報(bào)道 (表2)。其中，大腸桿菌基因組精簡幅度最高，為38.9%，枯草芽胞桿菌和阿維鏈霉菌的基因組精簡為18%～23%，其他微生物基因組精簡低于10%。

表2 不同微生物的精簡菌株特性Table 2 Characteristics of different microorganisms with minimal genome

續(xù)表2

3.1 大腸桿菌

大腸桿菌遺傳背景清晰，分子操作技術(shù)成熟，工業(yè)應(yīng)用潛力大，是構(gòu)建合成生物學(xué)底盤細(xì)胞的最佳選擇之一。自2002年以來，大腸桿菌基因組精簡幅度從5.6%提高至38.9%，其中，MGF(Minimumgenomefactory)和DGF(Designed genome factory)系列精簡菌株由W3110改造，其余精簡菌株則來自MG1655。這些精簡菌株生長基本正常，多數(shù)表現(xiàn)出底盤細(xì)胞的優(yōu)良特性。

精簡菌株Δ20-4[76]和 CDΔ3456[77]均通過隨機(jī)精簡非必需基因而獲得，生長正常，但未表現(xiàn)出其他優(yōu)良特性。Kolisnychenko等通過DSBR敲除系統(tǒng)定性敲除11個(gè)較大的和6個(gè)較小的K-組島 (K-island)獲得精簡菌株MDS12[65]，其在基本培養(yǎng)基中生長正常，穩(wěn)定期細(xì)胞量提高了約10%[65]。Posfai等在 MDS12的基礎(chǔ)上，通過DSBR敲除系統(tǒng)進(jìn)一步精簡了含基因組島的IS序列和含IS序列的單個(gè)基因，獲得 MDS41、MDS42和MDS43，其生長良好、遺傳穩(wěn)定、電轉(zhuǎn)化效率提高[66]。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，MDS42中L-蘇氨酸 (L-Thr)合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平有較大變化，其重組菌較野生菌產(chǎn)量提高83%[82]。Csorgo等通過突變SOS調(diào)控蛋白R(shí)ecA和LexA以及SOS誘導(dǎo)的DNA聚合酶PolII、PolIV和PolV，提高了MDS42的遺傳穩(wěn)定性[83]。這3個(gè)DNA聚合酶編碼基因的敲除突變株MDS42pdu的隨機(jī)突變率降低了50%左右，但生長依然正常[83]。MDS42pdu在施加環(huán)境脅迫或表達(dá)毒力蛋白 (ORF238)情況下，仍具有較強(qiáng)的遺傳穩(wěn)定性，可應(yīng)用于毒力蛋白的過表達(dá)研究[83]。

Hashimoto等參考 PEC(Profiling ofE.coliChromosome,http://shigen.lab.nig.ac.jp/ecoli/pec/)的非必需基因信息，通過同源重組和P1轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得菌株Δ16，精簡比例高達(dá)29.7%[46]。和MDS43相比，Δ16所精簡的單個(gè)大片段覆蓋范圍更寬，總敲除基因數(shù)更多，兩者公共敲除基因有435個(gè)[54]；但是Δ16生長減慢，細(xì)胞更長更寬，胞內(nèi)核酸分布更分散、更貼壁[46]。Iwadate等在Δ16的基礎(chǔ)上，通過同源重組進(jìn)一步精簡獲得Δ33，其精簡比例為38.9%，是目前最高的，但其生長特性較差[6]。Δ16和Δ33特性異常，并不適合作為底盤細(xì)胞。因此，理性選擇精簡區(qū)域?qū)蚪M精簡優(yōu)化非常關(guān)鍵。日本MGF項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)在CGH分析的基礎(chǔ)上，以3 Mbp的大腸桿菌小基因組模型為精簡目標(biāo)[78,84]。Mizoguchi等參考PEC信息通過同源重組和P1轉(zhuǎn)導(dǎo)理性敲除大片段獲得菌株MGF-01，精簡比例為 22.2%[54]。MGF-01所精簡的單個(gè)大片段覆蓋范圍較Δ16窄，所敲除基因總數(shù)比Δ16少146個(gè)，比MDS43多298個(gè)[54]；MGF-01與Δ16所敲除基因重疊 493個(gè)，與MDS43重疊568個(gè)[54]。MGF-01比野生型生長更好，其L-Thr代謝工程菌的產(chǎn)量更高，并具有較高的底物轉(zhuǎn)化率[54]。在生長和L-Thr生產(chǎn)方面，MGF-01比 MDS43和Δ16更有優(yōu)勢。通過對(duì)MGF-01進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)受YdfH抑制的饑餓感應(yīng)蛋白編碼基因rpsA上調(diào)[85]，因此，YdfH的缺失可能是導(dǎo)致其生長加快的原因之一。Hirokawa等在MGF-01的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步敲除2～3個(gè)大片段區(qū)域獲得 MGF-02，其生長較MGF-01更好[53]。在這2個(gè)MGF菌株基礎(chǔ)上，Hirokawa等通過回補(bǔ)表達(dá)ilvG和rph基因后，繼續(xù)合理精簡基因組，最終構(gòu)建了一系列DGF菌株，精簡比例最高達(dá)37.4%[53]。其中，DGF-348具有明顯的生長優(yōu)勢，DGF-327和DGF-298不含任何IS序列，生長更快且細(xì)胞終濃度增加，無營養(yǎng)缺陷性，DGF-298還表現(xiàn)出更好的遺傳穩(wěn)定性[53]。通過對(duì)DGF各精簡菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組水平分析，發(fā)現(xiàn)部分熱激性蛋白和蛋白激酶的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，這可能是其生長速率提高的主要原因[53]。

3.2 其他菌株

除大腸桿菌外，目前已報(bào)道的基因組精簡優(yōu)化的原核微生物主要有惡臭假單胞菌、枯草芽胞桿菌、谷氨酸棒桿菌和阿維鏈霉菌，真核微生物主要是釀酒酵母和栗酒裂殖酵母。

惡臭假單胞菌主要用于生產(chǎn)新型材料聚羥基脂肪酸 (Polyhydroxyalkanoates，PHA)，在合成塑料、燃料、高附加值醫(yī)療產(chǎn)品等方面有很高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。Leprince等通過轉(zhuǎn)座重組和FRT/Flp位點(diǎn)特異性重組隨機(jī)敲除以基因組島序列為主的非必需基因[72,80]，獲得菌株407.1-Δ2和407.3-Δ2；與野生型相比，這些菌株的生長正?；蚋肹80]。菌株407.3-Δ2缺失117個(gè)假蛋白和7個(gè)轉(zhuǎn)座酶的編碼基因，與遺傳性更穩(wěn)定的大腸桿菌MDS42的敲除基因重疊較多，因此推測其遺傳性更穩(wěn)定[80]?？莶菅堪麠U菌也是重要的工業(yè)生產(chǎn)菌，主要用于各種分泌蛋白酶的生產(chǎn)，近年來作為典型的模式微生物被廣泛研究，其精簡菌株主要有Δ6、MG1M和MGB874。Westers等通過敲除Prophage區(qū)域及聚酮化合物合成酶操縱子pks獲得Δ6，其生長代謝正常，但運(yùn)動(dòng)性和某些蛋白的分泌受到影響[79]。Ara等通過定性精簡Phage系列基因和抗生素合成相關(guān)基因獲得MG1M，其生長正常，纖維素酶生產(chǎn)能力提高[81]。Morimoto等通過同源重組敲除多個(gè)Prophage區(qū)域和11個(gè)非必需基因簇獲得MGB874，其重組菌纖維素酶和蛋白激酶的產(chǎn)量分別提高1.7倍和2.5倍，底物利用率也有所提高[56]；但MGB874具有生長缺陷性[56]，有待進(jìn)一步改善。谷氨酸棒桿菌常用于氨基酸、核苷酸和有機(jī)酸的生產(chǎn)。Suzuki等通過Cre/lox突變型位點(diǎn)特異性重組獲得菌株 RMD(190)[75]和 RD11[70]。RMD(190)所精簡的區(qū)域主要是11個(gè)菌株特異性基因組島(Strain-specific islands)，RD11所精簡區(qū)域除基因組島外還有功能未知的冗余基因，二者均生長正常[70]。阿維鏈霉菌是重要的驅(qū)蟲菌素等次級(jí)代謝物質(zhì)生產(chǎn)菌，有較強(qiáng)的初級(jí)代謝能力，可提供充足的前體和能量[47]。Komatsu等通過結(jié)合同源重組和Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組獲得菌株SUKA17。SUKA17中精簡了基因組中78%的轉(zhuǎn)座序列，總基因組精簡比例為18.5%[47]。SUKA17生長正常，遺傳穩(wěn)定，并具有良好的鏈霉素和頭霉素C生產(chǎn)特性，其中頭霉素C的合成量約提高 2.7 倍[47]。

釀酒酵母主要用于生產(chǎn)酒精、甘油等。Murakami等通過計(jì)算預(yù)測了609個(gè)目的敲除基因，采用PCR介導(dǎo)的基因組斷裂重組獲得了一系列精簡菌株[49]。其中，菌株MFY1160基因組精簡比例最高 (4.4%)，但其酒精和甘油的產(chǎn)量沒有明顯提高，MFY1158的甘油產(chǎn)量提高2倍，MFY1162酒精產(chǎn)量提高1.8倍[49]。栗酒裂殖酵母主要用于蛋白酶的生產(chǎn)。通過同源重組獲得栗酒裂殖酵母精簡菌株，精簡區(qū)域多于500 kb，但菌體有一定的生長缺陷性[50]。栗酒裂殖酵母的蛋白激酶缺失菌株也可大幅度提高外源蛋白的表達(dá)量，蛋白激酶的缺失可以減少對(duì)外源蛋白的降解，有利于構(gòu)建高效的外源蛋白生產(chǎn)菌。例如，利用缺失7個(gè)蛋白激酶的菌株MGF341構(gòu)建的重組菌生產(chǎn)人體生長激素，產(chǎn)量可提高30倍[50,63]。

4 展望

多種微生物通過基因組精簡優(yōu)化后表現(xiàn)出優(yōu)良特性，可見基因組精簡優(yōu)化是構(gòu)建合成生物學(xué)底盤細(xì)胞的有效手段?；蚪M精簡優(yōu)化的前提是確定精簡靶區(qū)域，其關(guān)鍵是建立完善的大片段敲除策略。目前仍有多種微生物存在較多功能未知基因，基因組精簡策略尚不成熟，這些問題是基因組精簡優(yōu)化工作的主要瓶頸。

首先，理性設(shè)計(jì)敲除靶區(qū)域和定性精簡對(duì)定向優(yōu)化基因組至關(guān)重要?；蚪M精簡優(yōu)化并非盲目敲除非必需基因，而是盡可能改造出只包含有利基因的微生物。同時(shí)，根據(jù)目的產(chǎn)物或功能模塊可進(jìn)一步優(yōu)化基因組以提高底盤細(xì)胞的適配性。每個(gè)必需基因的缺失都有可能導(dǎo)致生長缺陷性，應(yīng)盡量避免敲除這些基因。通過代謝網(wǎng)絡(luò)計(jì)算進(jìn)行定性精簡可獲得具有優(yōu)良特性的菌株，現(xiàn)有的小基因組微生物也為精簡區(qū)域的選擇提供了重要參考。大腸桿菌精簡菌株的敲除靶區(qū)域多為基因組島序列、Prophage區(qū)域、IS序列和冗余基因，還包括較多膜壁結(jié)構(gòu)相關(guān)基因。膜壁附屬結(jié)構(gòu)及膜蛋白相關(guān)基因的敲除有利于電轉(zhuǎn)化效率的提高[66]。革蘭氏陰性菌膜壁結(jié)構(gòu)包括鞭毛、纖毛、脂多糖、莢膜多糖和胞外分泌物等，其非必需結(jié)構(gòu)的精簡可能會(huì)減少菌體的糖耗，有利于提高細(xì)胞“經(jīng)濟(jì)效益”，改善細(xì)胞生產(chǎn)特性。惡臭假單胞菌天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶突變株的脂多糖合成量提高，而PHA合成量降低[86]，說明脂多糖的過量合成可能不利于PHA的合成[87-88]。對(duì)大腸桿菌脂多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行精簡優(yōu)化[89]，可提高細(xì)胞壁通透性，有利于產(chǎn)物分泌。

其次，建立精確高效的精簡策略是優(yōu)化基因組的關(guān)鍵所在。基于同源重組、DSBR重組和位點(diǎn)特異性重組的精簡策略可以精確敲除目的基因片段，有助于實(shí)現(xiàn)基因組的定性精簡。目前，多數(shù)微生物的大片段敲除技術(shù)尚不成熟或有待改善，可以根據(jù)不同微生物的遺傳特性選擇合適的敲除策略，并從菌株特性和具體策略兩方面進(jìn)一步提高精簡效率。通過構(gòu)建相應(yīng)的Red重組輔助質(zhì)粒，敲除內(nèi)源核酸酶RecJ、ExoI、ExoVII、ExoX和λExo，可以提高同源重組效率[90]，進(jìn)一步改造膜壁結(jié)構(gòu)可以改善轉(zhuǎn)化效率。綜合不同敲除系統(tǒng)的優(yōu)勢構(gòu)建更高效的精簡策略。例如，結(jié)合DSBR和Cre/loxP重組實(shí)現(xiàn)高效連續(xù)的無痕精簡；將Red酶系敲入到基因組上代替輔助質(zhì)粒簡化大片段敲除步驟；將不同重組酶 (如Red、Cre、Ⅰ-SceⅠ等)整合到1個(gè)質(zhì)粒上也可以簡化大片段敲除步驟。當(dāng)相鄰的敲除目的片段間只有幾個(gè)必需基因時(shí)，可以合理設(shè)計(jì)敲除盒實(shí)現(xiàn)相鄰目的片段的一步敲除。例如，采用DSBR敲除系統(tǒng)時(shí)，將必需基因連在敲除盒的同源臂A和B之間(圖1E)；采用Cre/loxP敲除系統(tǒng)時(shí)，將必需基因連在敲除盒的同源臂與loxP位點(diǎn)之間 (圖1F和G)。此外，涉及轉(zhuǎn)座重組的敲除策略具有一定的隨機(jī)性，但通過高通量轉(zhuǎn)座插入可以獲得較多突變株，進(jìn)而快速實(shí)現(xiàn)非必需基因敲除，同時(shí)便于功能未知基因的研究。在較多遺傳背景不清晰的微生物中，應(yīng)用轉(zhuǎn)座重組可能會(huì)推動(dòng)基因組精簡優(yōu)化工作的開展。

最后，深入了解微生物的各種調(diào)控機(jī)制是進(jìn)一步優(yōu)化精簡菌株的必要條件。微生物是一個(gè)全局精密調(diào)控的有機(jī)整體，通過控制微生物調(diào)控因子的表達(dá)，可以更好地優(yōu)化精簡菌株的生理特性。例如RpoS是影響生長的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，對(duì)其進(jìn)行位點(diǎn)突變可能會(huì)提高菌體生長速率。表達(dá)某些關(guān)鍵基因也可能改善菌體生長特性，同時(shí)避免高鹽環(huán)境和過量的ppGpp，或減少DksA、H-NS、Lrp蛋白和毒力蛋白的表達(dá)，可以降低微生物的生長抑制性[91-92]。通過增加基因組的起始復(fù)制子ori個(gè)數(shù)也可能會(huì)提高細(xì)胞生長速率或蛋白表達(dá)量[93]，進(jìn)一步改造相關(guān)基因還可以提高胞內(nèi)代謝能量和還原力。此外，異源表達(dá)較長基因簇的技術(shù)日益成熟，包括化學(xué)合成基因簇[94]和基因組敲入整合[95]，也為基因組精簡優(yōu)化菌株開辟了更廣闊的應(yīng)用前景。

基因組精簡優(yōu)化使微生物的整個(gè)系統(tǒng)更具潛力和操作性，同時(shí)也使我們更好地認(rèn)識(shí)和利用微生物。具有優(yōu)良特性的小基因組微生物作為合成生物學(xué)底盤細(xì)胞為功能模塊的引入提供了基礎(chǔ)平臺(tái)，選擇適配性較好的底盤細(xì)胞可使模塊高效發(fā)揮作用，最終成為理想的“細(xì)胞工廠”。這些“細(xì)胞工廠”在代謝產(chǎn)物生產(chǎn)、環(huán)境廢棄物降解、細(xì)胞毒素檢測和生物能源開發(fā)等領(lǐng)域具有更廣闊的應(yīng)用前景。

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