馮淼，王璐，田敬東

1中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津 300308

2中國科學院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308

對基因組學和蛋白質組學的大規(guī)模研究帶來了大量嶄新的信息、知識和技術，不僅推動了人類對生命過程和生物體結構功能相互關系的全面認識，也跨越式地提升了人類按需合成生命的能力，使合成生物學等新興學科應運而生。不管是探索生命本質，還是重構天然生物體系為人類服務，合成生物學的快速發(fā)展為應對人類社會發(fā)展所面臨的資源、環(huán)境、人口健康等重大挑戰(zhàn)提供了強有力的手段，成為引領生命科學和生物技術的重要前沿學科。

體外DNA合成技術是合成生物學最基礎、最有力的工具，可以突破傳統(tǒng)克隆技術的局限，實現(xiàn)從頭合成、按需合成和生物大分子的定向改造，如天然基因的異源表達、疫苗減活蛋白類藥物優(yōu)化、人工合成細胞工廠乃至人造生命體等。合成生物學的快速發(fā)展對人工合成基因的需求日益增長，相關課題一直是近年來國內外研究和專利申請的熱點[1]。近幾年，DNA化學合成和基因組裝技術取得了許多令人振奮的研究進展，這些新技術正在推動著基因合成技術向著高通量、高保真、自動化的方向發(fā)展。

1 基因合成技術

目前，人工合成基因的主要方法是以短鏈寡核苷酸作為原料，經(jīng)拼接組裝得到長鏈DNA[2-6]。柱式合成是寡核苷酸的常規(guī)來源，以多孔玻璃(Controlled pore glass，CPG)或聚苯乙烯(Polystyrene，PS)作為固相載體，微升級體積的化學試劑和溶劑通過抽壓流穿合成柱，經(jīng)脫保護、偶聯(lián)、封閉和氧化四步反應循環(huán)，使核苷酸單體不斷加成到增長的寡核苷酸鏈上[7-8]。近幾十年來，商品化的DNA合成儀普遍采用這種固相亞磷酰胺三酯法 (Phosphoramidite chemistry)生產(chǎn)寡核苷酸，但受副反應和各步化學反應效率的限制，為保證序列的完整性和產(chǎn)量，產(chǎn)物長度一般不超過200個堿基[9]。但是，隨著生物學各領域對人工合成基因需求的日益高漲，寡核苷酸合成的高成本、DNA合成長度的限制及由高錯誤率造成的高昂的后續(xù)測序費用等成為制約大規(guī)?；蚝铣珊突蚪M組裝的主要瓶頸。

隨著芯片在生物學領域應用的不斷拓展，近年來，基于芯片的寡核苷酸合成與基因組裝技術在合成質量、合成效率及自動化方面取得了許多突破性的新進展。芯片作為一種新型反應介質，具有集成、微縮和通量高的特點，使人們可以快速得到大量不同序列的寡核苷酸庫，在產(chǎn)量、試劑消耗和成本上具有明顯優(yōu)勢[4,10-12]。

但是，將芯片技術應用到基因合成中同樣存在著許多挑戰(zhàn)。首先，與柱式合成法相比，在芯片平面上合成的寡核苷酸錯誤率更高。其中一個誘因是脫保護試劑作用時間過長，導致出現(xiàn)“脫嘌呤”現(xiàn)象。針對這一問題，Agilent公司對試劑用量和反應條件進行了優(yōu)化，高保真合成了最長為200個堿基的寡核苷酸[9]。另一個誘因則是“邊緣效應”。芯片合成通常采用某種方法指導化學反應僅在硅芯片上的特定區(qū)域內進行，如Agilent公司采用噴墨打印的方法將皮升級的試劑噴射到芯片的特定區(qū)域內，LC Sciences和Affymetrix公司采用光活化的方法控制微流體系中的脫保護步驟，CombiMatrix公司則采用程控微電極陣列來控制某個點的氧化還原反應。在這些方法中，因液滴噴射錯位、光束漂移或試劑隔離不良而產(chǎn)生的“邊緣效應”會直接影響所合成序列的完整性。但這種不良效應也并非“無藥可救”，最近的研究發(fā)現(xiàn)在基于噴墨打印技術的芯片合成方法中，使用硅薄膜修飾的塑料芯片可有效減少“邊緣效應”的出現(xiàn)，使寡核苷酸合成錯誤率由1/200堿基降至1/600堿基，與柱式合成的寡核苷酸錯誤率相當[14]。

除了優(yōu)化芯片本身以外，新一代測序技術(Next-generation sequencing，NGS)的出現(xiàn)也為芯片基因合成技術的優(yōu)化提供了新的支持。NGS可以作為一種制備工具，在芯片上合成出來的寡核苷酸經(jīng)NGS儀器分析，序列正確的寡核苷酸被快速篩選出來并得到保留，用于下游基因組裝。經(jīng)過這一步篩分，所得產(chǎn)物的錯誤率可降低約500倍 (圖1b)[15]。芯片合成與NGS的結合實現(xiàn)了進一步的自動化，數(shù)百萬條寡核苷酸序列可以一次性測序并分離完成，使我們具備了構建Mbp級DNA的潛力。盡管將這項技術轉化為常規(guī)應用還需要進行很多優(yōu)化，但是將DNA合成與NGS相結合的概念還是十分具有吸引力和應用潛力的。

除此以外，如何提高寡核苷酸組裝的效率和準確性也是芯片基因合成技術面臨的一個重要挑戰(zhàn)。一塊芯片一般可以生產(chǎn)幾千到幾十萬條寡核苷酸，將如此大量的寡核苷酸組裝成序列、長度各異的基因，并將其從芯片表面收集、提取出來，是一項十分具有挑戰(zhàn)性的工作。Borovkov等應用寡核苷酸雜交-選擇原理[10]，對寡核苷酸序列和基因組裝條件進行了精心設計，使錯誤的寡核苷酸不能參與組裝反應，避免了費時費力且成本高昂的寡核苷酸純化和擴增步驟。使用這種方法，由芯片合成的寡核苷酸，只要純度高于95%，無需純化即可直接用于基因組裝[16]。另一種方法是選擇性擴增芯片上的寡核苷酸。Kosuri等對250 000條引物進行了精心設計，使選定片段能夠得到特異性擴增，用于后續(xù)組裝 (圖1c)。應用這種方法，Kosuri等成功完成了40條單鏈抗體基因的無錯組裝，由于含重復序列且GC含量高，這些基因在之前是難以合成的[17]。另外，寡核苷酸混合物溶液體積大、序列復雜度高也是導致基因組裝困難和易出錯的原因之一。針對這一誘因，本課題組提出一種優(yōu)化方法，即通過鑄壓及硅薄膜修飾等物理方法將芯片表面劃分為多個子池，在各子池中獨立合成寡核苷酸庫，并分別組裝成一條基因片段 (圖1d)。為進一步簡化下游組裝過程并降低成本，本課題組采用創(chuàng)新的組合酶體系，將寡核苷酸合成、擴增和基因組裝步驟整合到同一塊芯片的各個微池中，即實現(xiàn)了芯片的多功能化[18]。相對于常規(guī)方法，即通過化學裂解將寡核苷酸從芯片上釋放下來并經(jīng)純化后于片下 (Off-chip)進行基因組裝，我們采用等溫切口和鏈置換擴增反應 (Isothermal nicking and a strand displacement amplification reaction，nSDA)，在芯片上對寡核苷酸庫進行邊擴增邊釋放，隨后，無需更換緩沖溶液，即可在同一微池中繼續(xù)進行聚合酶拼接反應 (Polymerase cycling assembly，PCA)將寡核苷酸庫組裝成0.5～1 kb基因片段 (圖 1d)。如需合成更長的片段 (如10 kb)，可將1 kb小片段匯集到另一塊多功能芯片上，繼續(xù)合成多條長鏈DNA。

圖1 以芯片合成的寡核苷酸為原料進行基因組裝的相關方法。(a)芯片合成的寡核苷酸成本低、但錯誤率高、差異性大，需要經(jīng)適當?shù)暮Y分富集技術處理后組裝成基因。(b)利用下一代測序技術鑒定無錯序列。(c)對寡核苷酸混合物溶液進行選擇性擴增。(d)對芯片表面進行物理分區(qū)，寡核苷酸在芯片上各反應微池中被擴增并組裝成基因片段[13]Fig.1 Gene assembly strategies from microarray-derived oligonucleotides.(a)Oligonucleotides synthesized on a microarray are less expensive,but the high heterogeneity and error rate requires appropriate retrieval and segregation technologies to assembly them into gene constructs.(b)Next generation sequencing was used to identify error-free oligo sequences for gene assembly.(c)Selective amplification of oligonucleotides from the pool.(d)Physically dividing a microarray into isolated subarrays.Oligonucleotides are amplified and assembled into gene fragments on chip within each reaction well[13].

2 長鏈DNA和基因組合成技術

構建長度超過單一基因的長鏈DNA，需要面臨另一些挑戰(zhàn)。除了傳統(tǒng)的限制性酶消化和連接方法以外，還可以通過基于BioBrickTM[19]或BglBrick的方法[20]對基因片段進行拼接。在這些方法中，各基因片段通過含有限制性酶切位點的標準化側翼序列順序連接成更長的片段。盡管科研人員一直在嘗試對這種方法進行優(yōu)化，但是仍無法實現(xiàn)無痕組裝[21-22]。更重要的是，“抑制序列”的存在常常使限制性酶無法切割這些長鏈DNA。最近，有文獻報道利用Ⅱ型限制性酶可在其識別的序列附近切斷長鏈DNA，該發(fā)現(xiàn)使這一難題得到了初步的解決，但工作量十分繁重[23-26]。

限制性酶切-連接拼接法的替代方法主要包括幾種重疊延伸PCR技術 (Overlapping extension PCR，OE-PCR)，能夠實現(xiàn)不依賴序列的無痕組裝。在這類PCR反應中，同源末端將鄰近的DNA分子連接在一起，并于下一個循環(huán)引發(fā)擴增。環(huán)形聚合酶延伸法 (Circular polymerase extension，CPEC)是一種簡便的DNA片段組裝方法，已成功用于高通量平行組裝和組合庫的構建，只需一步反應即可將末端重疊的多個片段和載體連接成完整的環(huán)狀質粒，之后可直接轉化入細胞[27-28]。除此之外，還有In-Fusion(Clontech?的商品化試劑盒)[29]，尿嘧啶特異性切除試劑 (Uracil-specific excision reagent，USER)[30]及不依賴序列和連接反應的克隆 法 (Sequence-independent and ligationindependent cloning，SLIC)[31]。但是，這些方法更適用于質?；蛐⊥緩降臉嫿?，因為隨著產(chǎn)物長度的增加，PCR反應效率下降，錯誤率升高。而Gibson等溫組裝法 (Gibson isothermal assembly)卻是個例外，該法可以組裝長達幾百kb的基因組水平的片段[32]。應用類似的方法，直接利用柱合成的60-mer寡核苷酸成功構建出長達16.3 kb的線粒體基因組[33]。

不過，雖然上述體外基因組裝方法具有操作簡單等優(yōu)點，但受限于聚合酶的合成能力，20 kb似乎已達到了體外方法所能組裝的DNA序列長度的極限。對于更長的片段，采用釀酒酵母體內同源重組法進行拼接則更為有效。由于釀酒酵母對長片段的兼容性好且其DNA修復機制復雜、準確性高，該方法已被用于0.5～1 Mb細菌基因組的合成、交疊寡核苷酸的直接組裝及各種遺傳途徑的構建[34-36]。

如上所述，各種基因合成與組裝方法各有優(yōu)劣，表1給出了常用方法的簡要對比，可以根據(jù)合成產(chǎn)物的不同選擇最適方案。

3 錯誤修復技術

盡管已采取多種方法盡可能除去寡核苷酸合成產(chǎn)物中的錯誤，包括化學合成方法的優(yōu)化[9]，嚴格的雜交選擇[10,16]及全面徹底的純化，但是微量的錯誤依然會被帶入到組裝過程中，在下游基因片段中被累積。針對這個問題，目前主要根據(jù)錯配結合或錯配裂解原理，利用相關酶來減少這一階段的合成錯誤，最近的一篇綜述文章對基因合成中錯誤修復技術進行了詳細地介紹[37]。

值得注意的是，最近發(fā)表的兩項大規(guī)模芯片合成研究都采用了基于CEL的錯配特異性內切酶作為可靠的質量控制方法來顯著地降低錯誤率[17-18]。在這兩個基因錯誤修復反應中，錯配位點處被裂解或消化，余下的無錯片段被經(jīng) PCR反應被重新組裝成完整的基因。該修復過程可以重復進行，直至達到理想純度 (圖2)。據(jù)報道，經(jīng)過兩輪修復，合成基因的錯誤率可降低16倍以上，為 1/8 701 bp[38]。

圖2 基于CEL錯配特異性內切酶的合成基因錯誤修復反應原理圖。該錯誤修復循環(huán)可重復進行。每個循環(huán)包括4個步驟：(a)基因片段經(jīng)重新退火，使含錯誤堿基的錯配位點暴露。(b)CEL核酸內切酶在錯配位點3′端切斷雙鏈。(c)核酸外切酶或具校正功能的PCR聚合酶的3′->5′外切酶活性將突出的錯配位點切去。(d)經(jīng)交疊延伸PCR反應將所得片段重新組裝和擴增Fig.2 Schematic diagram of error correction strategy using CEL mismatch-specific endonuclease.Multiple CEL error-correction cycles maybe integrated into a genesynthesis process.Each cycle consists of four steps:(a)Reannealing of assembled gene constructs to present erroneous bases as mismatches.(b)CEL nuclease cleavage onboth strands at the 3′side of the mismatches.(c)Exonuclease trimming of single-stranded mismatch overhangs by added exonuclease or the 3′->5′exonuclease activity ofthe proofreading PCR enzyme.(d)Reassembly and amplification of the processed fragments by overlap extension PCR.

4 在合成生物學中的應用

生命科學快速發(fā)展使人們的研究思路和方法逐步從“分析”趨向于“綜合”、從“局部”發(fā)展到對“整體”的系統(tǒng)分析，而生物技術的研發(fā)目標也從對個別生物分子的“改造”提升到對復雜生命體系的“合成與構建”這一更高層次。從基因電路、代謝途徑到合成基因組乃至人造生命體構建，對合成基因的需求可謂無處不在[33,39-40]。

蛋白質表達的精確調控是合成生物學和生物技術領域的一項關鍵課題。大量的調控元件如啟動子和核糖體結合位點等都已被用于調控蛋白質表達。但是，如果編碼蛋白質的DNA序列本身在異源宿主中的表達不良，上述調控元件的優(yōu)化效果就十分有限了，需要進行密碼子優(yōu)化來重新設計和合成基因。由于到目前為止，人們對密碼子使用偏好的認識仍不完全，還做不到準確無誤地預測某種宿主對某種蛋白質的充分表達潛力，也不能保證軟件設計的序列經(jīng)能夠實現(xiàn)所需的蛋白表達水平。因此，常規(guī)的密碼子優(yōu)化方法常常給出錯誤的預言，難以獲得最優(yōu)結果，且反復實驗又會導致成本升高、工作周期延長。這不僅嚴重阻礙著生物醫(yī)藥等以蛋白質為主要研究目標或產(chǎn)品的領域的發(fā)展，也成為制約人工合成生物體系的設計和構建的主要瓶頸之一。本課題組將高通量芯片基因合成技術與快速基因庫組裝技術 (環(huán)形聚合酶延伸法，CPEC)相結合，建立了一套高通量基因合成與篩選方法，無需全面了解密碼子偏好規(guī)則，只需一輪合成和篩選即可以高可信度獲得所需蛋白表達水平的合成基因序列[18]。該方法不僅為系統(tǒng)研究蛋白質翻譯機理開辟了道路，也為大規(guī)?；?基因組合成與篩選、生物元器件和人工細胞工廠的構建提供了有力工具。

基因合成在代謝工程中的應用是合成生物學中最有希望帶來直接經(jīng)濟效益的研究領域，通過有目的改造現(xiàn)有的生物體，通過構建平行的代謝系統(tǒng)，與天然細胞代謝機器相互協(xié)同工作，研究人員可以根據(jù)實際應用設計細胞，如合成高值化學品或藥物等[41-42]。Keasling等在酵母中構建了青蒿素合成途徑，使這種藥物的微生物生產(chǎn)成本降為從稀有青蒿植物中提取的1/10。

芯片基因合成方法保真度的提高使研究人員可以直接利用芯片合成的寡核苷酸庫，結合多重自動基因組改造 (Multiplex-automated genome engineering，MAGE)與分級接合組裝基因組改造技術 (Hierarchicalconjugativeassembly genome engineering，CAGE)可對基因組上的多個位點乃至整個基因組進行密碼子優(yōu)化，讓編輯和進化同時進行成為了可能[43-44]。

在全基因組合成領域，基因合成技術最直接的應用目標是病毒基因組。病毒基因組較小，是疫苗研發(fā)的良好工程靶向。在代謝工程等領域進行密碼子優(yōu)化，通常是為了在異源宿主中得到更高的蛋白表達量，而疫苗研發(fā)則正好相反，需要通過全局密碼子去優(yōu)化來生產(chǎn)減毒的病毒。Coleman等開發(fā)了合成減毒病毒工程 (Synthetic attenuated virus engineering，SAVE)，即打亂病毒基因組固有的密碼子偏好，利用計算機對病毒基因組進行大規(guī)模重新設計[45]。最近經(jīng)SAVE設計的減毒流感病毒已成功獲得了有效疫苗[46]。隨著基因合成技術的迅速發(fā)展，病毒全基因組的重新設計和合成必將帶來巨大的經(jīng)濟效益。

5 結語

在過去的40年里，DNA從頭化學合成和基因組裝技術發(fā)展迅速，合成與組裝能力已從不足100 bp提高到106bp以上，在代謝工程、遺傳網(wǎng)絡設計和基因組合成方面具有廣泛的應用。但是，現(xiàn)有的DNA合成技術仍受到通量低、錯誤率高等瓶頸的制約，在大基因組合成方面的應用尚不夠成熟。通過各學科間的持續(xù)交叉協(xié)作，不斷涌現(xiàn)的基因合成與組裝的新方法、新技術必將推動復雜DNA庫和基因組構建技術的持續(xù)發(fā)展，對科學研究和社會產(chǎn)生巨大的影響。

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