顧群，李一凡，陳濤

1天津大學(xué)化工學(xué)院生物工程系，天津 300072

2教育部系統(tǒng)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072

合成生物學(xué)旨在工程學(xué)思想的指導(dǎo)下，從頭設(shè)計(jì)并構(gòu)建新的生物元件、模塊和系統(tǒng)，或?qū)ΜF(xiàn)有的、天然的生物系統(tǒng)進(jìn)行重新設(shè)計(jì)和改造[1]。利用合成生物學(xué)的工程思路，人們不僅建立了模擬物理學(xué)的基因電路，包括雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)、振蕩器、邏輯門等，還希望通過(guò)重新構(gòu)建生物代謝網(wǎng)絡(luò)，解決生物化工、生物能源、生物材料、生物醫(yī)藥領(lǐng)域以及關(guān)系國(guó)計(jì)民生的大問(wèn)題[2]。

對(duì)生物元件和系統(tǒng)進(jìn)行完全理性設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)生物系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化一直是合成生物學(xué)家多年追求的目標(biāo)[1,3]。代謝工程最早也致力于利用系統(tǒng)已知計(jì)量關(guān)系、動(dòng)力學(xué)方程及相關(guān)知識(shí)對(duì)細(xì)胞表型進(jìn)行理性修飾[4]。隨著系統(tǒng)生物學(xué)和各種組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對(duì)生物擾動(dòng)效果的預(yù)測(cè)能力及對(duì)生物系統(tǒng)理性設(shè)計(jì)的能力都逐漸增強(qiáng)[5]。然而，越來(lái)越多的研究也表明，由于生物系統(tǒng)的高度復(fù)雜性和非線性的特點(diǎn)，基因線路的完全理性設(shè)計(jì)通常無(wú)法實(shí)現(xiàn)功能最優(yōu)化。于是，一種“半理性”的工程方法——組合工程方法應(yīng)運(yùn)而生[6]。

組合優(yōu)化的工程思路包括以下3個(gè)元素：1)通過(guò)特定的技術(shù)手段構(gòu)建優(yōu)化對(duì)象 (基因線路，代謝網(wǎng)絡(luò)或細(xì)胞)的文庫(kù)。2)在文庫(kù)中篩選獲得功能優(yōu)化的對(duì)象。3)檢測(cè)并分析賦予對(duì)象優(yōu)化功能的要素[6]。組合優(yōu)化的技術(shù)思路與生產(chǎn)菌株的進(jìn)化相似，但其與傳統(tǒng)進(jìn)化方法相比仍有很大不同。傳統(tǒng)進(jìn)化更偏向于在基因組范圍內(nèi)進(jìn)行隨機(jī)突變，而組合優(yōu)化通常是對(duì)系統(tǒng)功能有影響的關(guān)鍵元素進(jìn)行集中突變或修飾來(lái)獲取最優(yōu)表型。這種集中突變的思路既可以更快速高效地獲得豐富的基因型或表型，又能同時(shí)避免不相關(guān)區(qū)域的不利突變。換言之，組合優(yōu)化是介于進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)之間的優(yōu)化策略，是一種對(duì)進(jìn)化的理性設(shè)計(jì)。本文介紹了組合優(yōu)化方法的工程策略和技術(shù)原理，聚焦于設(shè)計(jì)構(gòu)建文庫(kù)多樣性的方法，并總結(jié)和評(píng)述了組合工程方法在工程中的應(yīng)用及進(jìn)展 (表 1)。

1 單個(gè)元件的微調(diào)

生物元件是構(gòu)成合成基因線路的基本元素[1]，因此生物元件的特性和功能直接影響到合成基因線路的功能。一個(gè)新合成的基因線路通常需要對(duì)其組成元件進(jìn)行微調(diào)，以使線路發(fā)揮出最理想的效果。合成基因線路的元件包括復(fù)制起始位點(diǎn)、啟動(dòng)子、RBS序列、基因間序列、終止子、功能蛋白等等[7]，通過(guò)對(duì)上述各單個(gè)元件的微調(diào)可以改善基因線路的性能。

1.1 優(yōu)化質(zhì)粒的拷貝數(shù)

現(xiàn)今絕大多數(shù)功能線路和代謝通路都是在質(zhì)粒上構(gòu)建，而質(zhì)?？截悢?shù)對(duì)基因線路的功能會(huì)產(chǎn)生一定影響。高拷貝質(zhì)粒使功能蛋白基因獲得高水平表達(dá)的同時(shí)，卻給細(xì)胞帶來(lái)較大的生理負(fù)擔(dān)。此外，代謝通路中特定酶的高水平表達(dá)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性物質(zhì)，阻礙細(xì)胞行使某些必需功能。Jones等發(fā)現(xiàn)，將表達(dá)DXP合酶的基因從高拷貝數(shù)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到低拷貝數(shù)的質(zhì)粒上，番茄紅素的產(chǎn)量可以提高2～3倍[8]。然而如今代謝工程和合成生物學(xué)中可供選擇的質(zhì)粒仍然比較有限，且一些質(zhì)粒之間具有不相容性 (比如pSC101和p15A)，因此通過(guò)改變質(zhì)?？截悢?shù)還無(wú)法實(shí)現(xiàn)功能元件表達(dá)強(qiáng)度的連續(xù)性微調(diào)。

表1 合成生物系統(tǒng)的組合優(yōu)化方法的研究進(jìn)展Table 1 Summary of research on combinatorial optimization of synthetic biological systems

1.2 合成啟動(dòng)子文庫(kù)

啟動(dòng)子是結(jié)構(gòu)基因上游起始轉(zhuǎn)錄的一段序列，它的強(qiáng)度決定了結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度，因此啟動(dòng)子成為優(yōu)化基因線路功能的一個(gè)重要對(duì)象。Alper等最先使用構(gòu)建啟動(dòng)子文庫(kù)的方法來(lái)優(yōu)化代謝通路[9]。他們首先用易錯(cuò)PCR法在高性能天然啟動(dòng)子中引入點(diǎn)突變，隨機(jī)引入的點(diǎn)突變使文庫(kù)中的啟動(dòng)子具有不同的強(qiáng)度，由此構(gòu)建了大腸桿菌PLteto-1啟動(dòng)子文庫(kù)和釀酒酵母TEF啟動(dòng)子文庫(kù)。之后，作者利用獲得的文庫(kù)優(yōu)化了dxs基因的表達(dá)強(qiáng)度，以提高番茄紅素的產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子強(qiáng)度最大時(shí)，菌株生產(chǎn)番茄紅素的產(chǎn)量并非最高，最高產(chǎn)番茄紅素菌株的代謝通路上啟動(dòng)子的強(qiáng)度僅為中等，這一現(xiàn)象說(shuō)明基因表達(dá)強(qiáng)度過(guò)高并不能使菌株獲得相對(duì)優(yōu)化的產(chǎn)量。Ellis等通過(guò)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，構(gòu)建了具有不同表達(dá)強(qiáng)度和抑制強(qiáng)度的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子文庫(kù)，這種方法成功應(yīng)用于前饋環(huán)和計(jì)時(shí)器的微調(diào)，最終實(shí)現(xiàn)了對(duì)酵母沉降時(shí)間的控制[10]。此方法并不完全局限于進(jìn)行非理性微調(diào)，而是將非理性的優(yōu)化與理性的模型預(yù)測(cè)進(jìn)行結(jié)合，從而降低了優(yōu)化代謝通路的時(shí)間和成本。如今，啟動(dòng)子文庫(kù)在很多宿主細(xì)胞中都能被構(gòu)建出來(lái)，它們能用于優(yōu)化很多生物系統(tǒng)的功能。

1.3 基于RBS位點(diǎn)的調(diào)控工具

RBS位點(diǎn)是調(diào)節(jié)翻譯強(qiáng)度的重要元件。Salis等結(jié)合熱力學(xué)模型開發(fā)了RBS計(jì)算器 (RBS calculator)，可以理性設(shè)計(jì)所需強(qiáng)度的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列[11]。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)RBS序列的強(qiáng)度并不是一定的，而會(huì)受其所表達(dá)基因序列的影響，同樣的RBS表達(dá)不同的基因序列，其表達(dá)強(qiáng)度的差異可達(dá)10倍之多，這為理性設(shè)計(jì)帶來(lái)了額外的困難，因此有必要通過(guò)組合的方法對(duì)生物元件進(jìn)行微調(diào)。RBS計(jì)算器另一個(gè)重要功能是設(shè)計(jì)RBS的簡(jiǎn)并序列，生成一個(gè)表達(dá)強(qiáng)度在所需范圍內(nèi)變化的序列文庫(kù)。因?yàn)镽BS序列很短，人工設(shè)計(jì)的RBS文庫(kù)可以很方便地通過(guò)引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增來(lái)實(shí)現(xiàn)與特定基因的連接，從而對(duì)基因表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行微調(diào)。

Egbert等開發(fā)了一種利用RBS序列中“簡(jiǎn)單重復(fù)序列”(Simple sequence repeats)(SSR)來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)強(qiáng)度的方法[12]。這種方法有3個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一是重復(fù)序列的長(zhǎng)度與RBS序列的強(qiáng)度具有相關(guān)性，這使得該法具有表達(dá)強(qiáng)度的可預(yù)測(cè)性；二是SSR對(duì)基因表達(dá)強(qiáng)度的調(diào)節(jié)范圍非常廣，它們可使基因表達(dá)強(qiáng)度最多相差1 000倍；三是這種重復(fù)序列不穩(wěn)定，可以通過(guò)PCR法或者組合組裝法來(lái)對(duì)其進(jìn)行快速突變。為了證明這個(gè)方法的實(shí)用性，作者用SSR微調(diào)了一個(gè)雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)系統(tǒng)中兩個(gè)抑制蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。值得一提的是，作者發(fā)現(xiàn)雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)系統(tǒng)的功能具有菌株特異性，同樣的開關(guān)，在實(shí)驗(yàn)菌株中表現(xiàn)良好，而放到另外一株工業(yè)菌中可能會(huì)喪失其功能。

1.4 優(yōu)化可調(diào)控基因間序列 (TIGRs)

基因間序列的改變也會(huì)對(duì)基因表達(dá)強(qiáng)度產(chǎn)生重大影響。Pfleger等通過(guò)可調(diào)控基因間序列(Tunable intergenic regions，TIGRs)，實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)操縱子內(nèi)，對(duì)多個(gè)基因表達(dá)強(qiáng)度的同時(shí)調(diào)節(jié)[13]。TIGRs由多種控制元件組成，它們包括：mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、核糖核酸酶 (RNase)斷裂位點(diǎn)及RBS隔離序列，通過(guò)改變這些序列可以在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)節(jié)。作者利用TIGR法對(duì)三基因的甲羥戊酸生物合成途徑進(jìn)行微調(diào)，將甲羥戊酸的產(chǎn)量提高了7倍。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲羥戊酸產(chǎn)量提高了7倍時(shí)，其中兩種基因——hmgs和tHMGR的活性是降低的。由此可見這些組合優(yōu)化策略的確能產(chǎn)生超出預(yù)期的有利突變體。

2 代謝通路的系統(tǒng)優(yōu)化

在合成生物系統(tǒng)的優(yōu)化過(guò)程中，只進(jìn)行單個(gè)元件的調(diào)節(jié)往往難以實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)功能的最優(yōu)化。生物系統(tǒng)的各個(gè)部分之間是緊密聯(lián)系并且互相協(xié)調(diào)的，單一元件的過(guò)度擾動(dòng)經(jīng)常會(huì)影響其他元件的功能調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致代謝失衡。大量代謝控制分析方面的研究表明：許多代謝通路的主要通量控制步驟往往分布在多個(gè)反應(yīng)中，代謝通路的優(yōu)化需要同時(shí)對(duì)這些反應(yīng)進(jìn)行微調(diào)以保持代謝平衡。否則，代謝失衡將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)某些中間代謝物濃度過(guò)度波動(dòng)，從而對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)或性能造成損害。同時(shí)，過(guò)度表達(dá)的基因也會(huì)給細(xì)胞帶來(lái)沉重的代謝負(fù)擔(dān)。另外，不同元件對(duì)系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)作用有時(shí)會(huì)有協(xié)同效應(yīng)，對(duì)單個(gè)元件的擾動(dòng)往往只能對(duì)系統(tǒng)功能產(chǎn)生微小的影響，而對(duì)多個(gè)元件的同時(shí)修飾能更好地優(yōu)化系統(tǒng)的功能。由此可見，合成系統(tǒng)中各個(gè)部分的組合優(yōu)化對(duì)獲得最優(yōu)化功能是極為重要的。

2.1 多元模塊工程

多元模塊工程 (Multiple module engineering)是一種能進(jìn)行代謝通路組合優(yōu)化的有效策略[14-15]。其工程思路是將整個(gè)代謝通路分成不同的模塊，再通過(guò)系統(tǒng)地改變各個(gè)模塊的復(fù)制起始位點(diǎn)，啟動(dòng)子或者RBS序列來(lái)協(xié)調(diào)不同模塊的表達(dá)強(qiáng)度(圖1A)。利用多元模塊工程策略，只需組合構(gòu)建少數(shù)的模塊組合，就可以在大范圍內(nèi)優(yōu)化代謝通路。

多元模塊工程已成功運(yùn)用于生物產(chǎn)品產(chǎn)量的工程優(yōu)化，其最成功的例子是Ajikumar等對(duì)紫杉二烯代謝通路的優(yōu)化[14]。作者將整個(gè)通路分成兩個(gè)部分：一為包含內(nèi)源的MEP通路合成異戊烯焦磷酸的上游模塊；二為包含外源的萜類化合物合成途徑的下游模塊。之后用不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子和不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒與兩個(gè)模塊組合，或?qū)⒉煌瑥?qiáng)度的啟動(dòng)子與某個(gè)模塊組合后整合到基因組上再進(jìn)行表達(dá)。作者共構(gòu)建了32種不同組合的菌株，并從中成功分離了高產(chǎn)紫杉二烯的菌株，其最高產(chǎn)量能達(dá)到1 g/L，是對(duì)照菌株的15 000倍。更為有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)最高產(chǎn)量菌株的上游模塊是整合到基因組上的，表達(dá)強(qiáng)度很弱，而這恰好平衡了兩個(gè)模塊的代謝通量，降低了胞內(nèi)吲哚的積累，從而解除了吲哚對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。

利用相似工程思路，Xu等將脂肪酸代謝通路分成3個(gè)模塊：上游的乙酰輔酶A合成模塊、中游的乙酰輔酶A激活模塊和下游的脂肪酸合成模塊。作者通過(guò)改變這3個(gè)模塊的拷貝數(shù)，使乙酰輔酶A的合成和丙二酰輔酶A的消耗達(dá)到平衡，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多個(gè)模塊表達(dá)強(qiáng)度的組合優(yōu)化。為了進(jìn)一步提高產(chǎn)量，作者又將上游模塊和下游模塊基因的RBS位點(diǎn)進(jìn)行組合微調(diào)，進(jìn)一步將產(chǎn)量提高了46%[16]。

2.2 基于基因合成技術(shù)的組合優(yōu)化工具

多元模塊工程也有其內(nèi)在的缺點(diǎn)，它通常使用傳統(tǒng)的酶切連接技術(shù)，構(gòu)建非常有限的模塊組合 (不超過(guò)100)，而難以進(jìn)行高通量的系統(tǒng)優(yōu)化。近幾年基因合成技術(shù)取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，許多基于重疊延伸技術(shù)和同源重組技術(shù)的多片段組裝技術(shù)如雨后春筍般涌現(xiàn)出來(lái)[17-23]。相比傳統(tǒng)的酶切連接克隆技術(shù)，這些多片段組裝技術(shù)通常具以下3個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一是它們對(duì)克隆序列的依賴性較低，不需要酶切位點(diǎn)的輔助；二是能夠?qū)崿F(xiàn)多個(gè)片段的同時(shí)組裝；三是其中某些技術(shù)具有高效克隆多片段的能力，能用來(lái)生成比較大的文庫(kù)，因此具有對(duì)代謝通路中多個(gè)元件進(jìn)行組合優(yōu)化的能力[22]。

Shao等基于其實(shí)驗(yàn)室早前開發(fā)的“DNA組裝器 (DNA assembler)[19]”技術(shù)，又開發(fā)了一種名為“組合轉(zhuǎn)錄工程優(yōu)化法 (COMPACTER)”的技術(shù)，此技術(shù)通過(guò)將不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子與不同代謝通路的基因進(jìn)行組合，之后再運(yùn)用高通量的篩選方法來(lái)構(gòu)建篩選出最高效的代謝通路，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)代謝通路中多個(gè)基因表達(dá)強(qiáng)度的組合優(yōu)化(圖1B)，該技術(shù)已成為將組裝技術(shù)成功應(yīng)用于代謝通路組合優(yōu)化的經(jīng)典案例[24]。利用此法，Du等優(yōu)化了酵母細(xì)胞中木糖和纖維二糖的利用途徑，僅通過(guò)一輪的COMPACTER就獲得了當(dāng)時(shí)文獻(xiàn)報(bào)道的最高效的利用途徑。這些優(yōu)化的木糖和纖維二糖利用途徑具有菌株特異性，即從實(shí)驗(yàn)室菌株和工業(yè)菌株出發(fā)，各自優(yōu)化得到的最優(yōu)代謝通路是不同的，而且同一個(gè)代謝通路在實(shí)驗(yàn)室菌株和工業(yè)菌株中會(huì)有截然不同的表現(xiàn)。該技術(shù)可以做到量體裁衣，為不同背景的菌株“定制”其特有的最優(yōu)代謝通路。

Gibson組裝技術(shù)[23]也可以對(duì)基因線路進(jìn)行組合組裝。JCVI實(shí)驗(yàn)室的Ramon等利用Gibson組裝將3個(gè)啟動(dòng)子 (recA，ssb，lacI)和4個(gè)物種中的乙酸代謝通路 (ackA，pta)進(jìn)行了隨機(jī)的組合組裝，一個(gè)反應(yīng)就能得到104的文庫(kù)。作者用菌落PCR法檢測(cè)了37個(gè)克隆后發(fā)現(xiàn)，其中81%含有正確長(zhǎng)度的序列，然而遺憾的是作者并沒有對(duì)文庫(kù)的質(zhì)量和多樣性做進(jìn)一步的研究[25]。

圖1 系統(tǒng)優(yōu)化代謝通路的組合工程工具 (A:多元模塊工程；B:組合轉(zhuǎn)錄工程優(yōu)化法；C:迭代重組法)Fig.1 Combinatorial engineering tools for systematically optimization of metabolic pathways.(A)Multiple module engineering.(B)COMPACTER technology.(C)Reiterative recombination.

Quan等開發(fā)了一種名為環(huán)形聚合酶延伸法(Circular polymerase extension cloning，CPEC) 的技術(shù)，此技術(shù)能將末端重疊的多個(gè)片段和載體一步連接成完整的環(huán)狀質(zhì)粒，然后得到的質(zhì)?？芍苯愚D(zhuǎn)化入細(xì)胞以進(jìn)行篩選克隆[26]。作者將含1.7 kb的HIV病毒包膜基因gp120分成等長(zhǎng)的兩個(gè)片段，每個(gè)片段都含有密碼子變體。通過(guò)CPEC方法將兩個(gè)片段和質(zhì)粒骨架進(jìn)行組裝得到反應(yīng)產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化1 pmol反應(yīng)產(chǎn)物可以獲得2.436×105的克隆，從而證實(shí)了其組合組裝的強(qiáng)大能力。

另一個(gè)特別的構(gòu)建多基因代謝通路文庫(kù)的方法是Cornish實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的“迭代重組法(Reiterative recombination)”[27]，迭代重組法可以用于構(gòu)建大于104的代謝通路文庫(kù)。此方法利用酵母的同源重組系統(tǒng)及幾種循環(huán)使用篩選標(biāo)記，可以迭代地在酵母基因組中構(gòu)建多基因代謝通路 (圖1C)。作者用這個(gè)技術(shù)構(gòu)建了crtE、crtB、crtI的三基因的番茄紅素代謝通路。

2.3 多元質(zhì)粒工程

本實(shí)驗(yàn)室結(jié)合之前提到的RBS計(jì)算器設(shè)計(jì)出一系列ssDNA，基于ssDNA重組技術(shù)構(gòu)建了多元質(zhì)粒工程 (MIPE)。MIPE技術(shù)可以同時(shí)高效地修改質(zhì)粒上多個(gè)位點(diǎn)。作者利用MIPE技術(shù)對(duì)核黃素代謝通路的5個(gè)基因的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行了組合優(yōu)化，僅在1周內(nèi)就獲得了核黃素產(chǎn)量提高2.6倍的克隆。

3 基因組范圍內(nèi)靶點(diǎn)的識(shí)別和組合修飾

全局調(diào)控因子和一些看似不相關(guān)基因的改變都會(huì)對(duì)生物系統(tǒng)的功能產(chǎn)生影響，從而造就系統(tǒng)的復(fù)雜性。因此，為了獲得最優(yōu)的生物學(xué)功能，通常需要在全基因組范圍內(nèi)尋找基因靶點(diǎn)，再對(duì)其進(jìn)行組合優(yōu)化。

3.1 基因組范圍內(nèi)靶點(diǎn)的識(shí)別

轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變是在全基因組范圍內(nèi)搜索目標(biāo)靶點(diǎn)的有效方法，盡管早前插入序列更傾向于插入某些熱點(diǎn)區(qū)域，但如今系統(tǒng)經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，插入序列已能高效均勻地插入到整個(gè)基因組中。一些能進(jìn)行基因組基因隨機(jī)強(qiáng)表達(dá)的技術(shù)可以與轉(zhuǎn)座子隨機(jī)敲除技術(shù)互補(bǔ)，Jin等將大腸桿菌基因組切割并隨機(jī)連入到質(zhì)粒中進(jìn)行表達(dá)，以此來(lái)篩選番茄紅素高產(chǎn)菌株，最后作者成功發(fā)現(xiàn)了對(duì)番茄紅素的產(chǎn)量有不同程度提高的16個(gè)不同位點(diǎn)[28]。

3.2 全轉(zhuǎn)錄工程 (gTME)

全轉(zhuǎn)錄工程 (Global transcription machinery engineering，gTME)是一種重構(gòu)轉(zhuǎn)錄組的新方法[29]。它通過(guò)對(duì)菌株的全局轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行突變，以在全局范圍內(nèi)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)強(qiáng)度 (圖2A)。Alper等通過(guò)在大腸桿菌σ因子中引入突變，篩選到一系列最優(yōu)表型菌株，如具有乙醇、十二烷基鈉耐受性且能高產(chǎn)番茄紅素的菌株。利用類似方法，對(duì)釀酒酵母的TATA盒結(jié)合蛋白進(jìn)行突變，分離了一株具有高度葡萄糖/乙醇耐受性的菌株，其乙醇的體積生產(chǎn)力提高了70%[30]。

3.3 可追蹤多元重組工程 (TRMR)與多元自動(dòng)化基因組工程 (MAGE)

合成生物學(xué)的飛速發(fā)展催生了一些更加強(qiáng)大的技術(shù)，這些技術(shù)可以高通量且快速地搜索或修改基因組。Warner等開發(fā)了可追蹤多元重組工程 (Trackable multiplex recombineering，TRMR)，能同時(shí)對(duì)基因組上千個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行分析和修飾[31](圖2B)。作者利用TRMR技術(shù)成功獲得了不同抑制劑存在下大腸桿菌的生長(zhǎng)圖譜。經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，一些基因的敲除和強(qiáng)表達(dá)都可以使大腸桿菌對(duì)不同抑制劑產(chǎn)生耐受性。利用此技術(shù)，作者還得到了使細(xì)胞耐受纖維素水解液的基因修飾，這一研究成果對(duì)工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域有著重要的意義。TRMR技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)是可以在非常短的時(shí)間內(nèi)，只需消耗較低成本就可以獲得上千個(gè)基因敲除和強(qiáng)表達(dá)的細(xì)菌，之后輔助微陣列技術(shù)就能對(duì)這些文庫(kù)進(jìn)行簡(jiǎn)單快速的追蹤，使基因功能研究的通量提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)。然而在單輪操作中，利用TRMR技術(shù)通常只能對(duì)單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生單個(gè)基因修飾，因此現(xiàn)今TRMR技術(shù)難以用于研究那些需要兩個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)修飾才能獲得的特定細(xì)胞表型。

多元自動(dòng)化基因組工程 (Multiplex automated genome engineering，MAGE)作為另一種強(qiáng)大的高通量修改基因組的工具，能同時(shí)瞄準(zhǔn)并改造單個(gè)細(xì)胞基因組上的多個(gè)靶點(diǎn)，從而在一個(gè)細(xì)胞群體中形成組合的基因組多樣性[32](圖2C)。這種多元化方法是一種基于進(jìn)化的理性設(shè)計(jì)法，與傳統(tǒng)進(jìn)化方法相比，此法能使進(jìn)化更加理性快速地進(jìn)行。作者又利用MAGE技術(shù)循環(huán)性和可升級(jí)性 (Scalable)的特點(diǎn)，專門為此技術(shù)建造了一個(gè)自動(dòng)化機(jī)器，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了多元基因組工程的自動(dòng)化，此機(jī)器能用來(lái)快速連續(xù)地產(chǎn)生不同基因突變的集合。為了檢驗(yàn)MAGE技術(shù)的實(shí)用性，作者試圖對(duì)番茄紅素生產(chǎn)途徑上的24個(gè)基因進(jìn)行同時(shí)優(yōu)化。一天內(nèi)，借助自動(dòng)化機(jī)器可以產(chǎn)生數(shù)十億個(gè)不同基因型的突變株，經(jīng)過(guò)3 d的進(jìn)化，就能從中挑選到番茄紅素生產(chǎn)能力提高5倍的菌株。之后該作者還利用MAGE技術(shù)，成功地將大腸桿菌中314個(gè)TAG終止密碼子定點(diǎn)修改成TAA，由此獲得一株不含有TAG終止密碼子的菌株[33]。

TRMR技術(shù)和MAGE技術(shù)一經(jīng)出現(xiàn)就在相關(guān)領(lǐng)域掀起軒然大波，研究者很快發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)技術(shù)具有互補(bǔ)性，若能將其有效結(jié)合將會(huì)產(chǎn)生一個(gè)更強(qiáng)大的研究策略，即先利用TRMR技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)尋找基因靶點(diǎn)，再用MAGE技術(shù)對(duì)發(fā)現(xiàn)的基因的表達(dá)強(qiáng)度組合微調(diào)，Sandoval等很快就進(jìn)行了這種嘗試[34]。他們首先利用TRMR技術(shù)去尋找細(xì)胞耐受乙酸纖維素裂解液和弱堿環(huán)境的基因，發(fā)現(xiàn)有27個(gè)基因的表達(dá)會(huì)對(duì)菌株的耐受性產(chǎn)生較大影響。之后又通過(guò)MAGE技術(shù)來(lái)修改這27個(gè)基因的RBS位點(diǎn)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)其表達(dá)強(qiáng)度的組合微調(diào)，最終獲得了比野生型菌株生長(zhǎng)快10%～200%的一系列菌株。

3.4 基于RNA的組合修飾工具

不同于上述基于DNA修飾的技術(shù)，Na等又開發(fā)了一種利用小型調(diào)控RNA對(duì)大腸桿菌進(jìn)行代謝工程操作的技術(shù)[35]。它通過(guò)表達(dá)的sRNA與靶向基因轉(zhuǎn)錄翻譯區(qū)域的結(jié)合，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)翻譯過(guò)程的阻遏作用，進(jìn)而下調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)。此技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于：在不修改基因組的情況下，此技術(shù)也能調(diào)節(jié)基因的表達(dá)強(qiáng)度，而且通過(guò)將sRNA與DNA結(jié)合區(qū)域結(jié)合，它能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)強(qiáng)度的微調(diào)。利用這個(gè)技術(shù)，作者對(duì)酪氨酸生物合成途徑進(jìn)行了優(yōu)化，他們針對(duì)14株不同菌株內(nèi)的4個(gè)基因進(jìn)行了表達(dá)強(qiáng)度的組合下調(diào)，并最終獲得了可以生產(chǎn)2 g/L酪氨酸的菌株。之后，作者又合成了與戊二胺生物合成相關(guān)的基因?qū)?yīng)的130種sRNA，其中發(fā)現(xiàn)murE的弱表達(dá)可以使戊二胺產(chǎn)量提高55%。

4 結(jié)論與展望

生物系統(tǒng)組合優(yōu)化已經(jīng)成為合成生物學(xué)和代謝工程必要的組成部分?？傮w上講，生物系統(tǒng)組合優(yōu)化的策略有以下兩個(gè)發(fā)展方向：1)基因修飾和改造的方法會(huì)逐漸趨向于多元化，強(qiáng)調(diào)多位點(diǎn)的同時(shí)修改。2)基因靶點(diǎn)的選擇將越來(lái)越精確，文庫(kù)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建工作也會(huì)越來(lái)越理性，從而減小對(duì)高通量篩選的需求。隨著基因合成和修飾技術(shù)的快速發(fā)展，將會(huì)有更高效的工程工具被開發(fā)出來(lái)。如近期出現(xiàn)的CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組工程技術(shù)，迅速成為研究的熱點(diǎn)[36-38]。此技術(shù)不僅能進(jìn)行細(xì)菌基因組的高效修飾[36]，還通過(guò)與RNAi技術(shù)相似的方法在不修改基因組的情況下調(diào)節(jié)基因的強(qiáng)度[39](圖2D)。雖然還沒有報(bào)道暗示這個(gè)技術(shù)能用于進(jìn)行組合優(yōu)化，然而不可否認(rèn)，此技術(shù)具有被開發(fā)成一種強(qiáng)大組合優(yōu)化工程工具的巨大潛力。筆者認(rèn)為，利用傳統(tǒng)的單基因敲除法或強(qiáng)表達(dá)法來(lái)進(jìn)行菌株優(yōu)化的時(shí)代已經(jīng)過(guò)去，研究者將會(huì)將更多的重點(diǎn)放在組合工程策略上，或選擇一種合適高效的組合工程技術(shù)，或是將不同技術(shù)相結(jié)合，以此來(lái)優(yōu)化目標(biāo)性狀，最終為構(gòu)建生物的新功能提供更多有利條件。

圖2 基因組范圍內(nèi)進(jìn)行組合修飾的組合工程工具及一個(gè)具有潛力的基因工程新技術(shù) (A：全轉(zhuǎn)錄工程；B：可追蹤多元重組工程；C：多元自動(dòng)化基因組工程；D：CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組工程技術(shù))Fig.2 Combinatorial engineering tools for introducing combinatorial genome wide modification and a new promising genetic engineering technology.(A)Global transcription machinery engineering(gTME).(B)Trackable multiplex recombineering(TRMR).(C)Multiplex automated genome engineering(MAGE).(D)CRISPR-Cas9 technology.

[1]Endy D.Foundations for engineering biology.Nature,2005,438(7067):449?453.

[2]Khalil AS, Collins JJ. Synthetic biology:applications come of age.Nat Rev Genetics,2010,11(5):367?379.

[3]Prather KL,Martin CH.De novo biosynthetic pathways:rational design of microbial chemical factories.CurrOpin Biotechnol,2008,19(5):468?474.

[4]Stephanopoulos G,Alper H,Moxley J.Exploiting biological complexity for strain improvement through systems biology.Nat Biotechnol,2004,22(10):1261?1267.

[5]Tyo KE,Alper HS,Stephanopoulos GN.Expanding the metabolic engineering toolbox:more options to engineer cells.Trends Biotechnol,2007,25(3):132?137.

[6]Santos CN,Stephanopoulos G.Combinatorial engineering of microbes for optimizing cellular phenotype.Curr Opin Chem Biol,2008,12(2):168?176.

[7]Voigt CA.Genetic parts to program bacteria.Curr Opin Biotechnol,2006,17(5):548?557.

[8]JonesKL,Kim SW,KeaslingJD.Low-copy plasmids can perform as well as or better than high-copy plasmids for metabolic engineering of bacteria.Metab Eng,2000,2(4):328?338.

[9]Alper H,Fischer C,Nevoigt E,et al.Tuning genetic control through promoter engineering.Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(36):12678?12683.

[10]Ellis T,Wang X,CollinsJJ.Diversity-based,model-guided construction of synthetic gene networks with predicted functions.Nat Biotechnol,2009,27(5):465?471.

[11]Salis HM,Mirsky EA,Voigt CA.Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression.Nat Biotechnol,2009,27(10):946?950.

[12]Egbert RG,Klavins E.Fine-tuning gene networks using simple sequence repeats.Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(42):16817?16822.

[13]Pfleger BF,Pitera DJ,Smolke CD, et al.Combinatorial engineering of intergenic regions in operons tunes expression of multiple genes.Nat Biotechnol,2006,24(8):1027?1032.

[14]Ajikumar PK,Xiao WH,Tyo KE,et al.Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction inEscherichia coli.Science,2010,330(6000):70?74.

[15]Yadav VG,De Mey M,Lim CG,et al.The future of metabolic engineering and synthetic biology:towards a systematic practice.Metab Eng,2012,14(3):233?241.

[16]Xu P,Gu Q,Wang W,et al.Modular optimization of multi-gene pathways for fatty acids production inE.coli.Nat Commun,2013,4:1409.

[17]Geu-Flores F,Nour-Eldin HH,Nielsen MT,et al.USER fusion:a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products.Nucleic Acids Res,2007,35(7):e55.

[18]SleightSC,Bartley BA,LieviantJA,etal.In-Fusion BioBrick assembly and re-engineering.Nucleic Acids Res,2010,38(8):2624?2636.

[19]Shao Z,Zhao H.DNA assembler,anin vivogenetic method forrapid construction ofbiochemical pathways.Nucleic Acids Res,2009,37(2):e16.

[20]Quan J,Tian J.Circular polymerase extension cloning for high-throughput cloning of complex and combinatorial DNA libraries.Nat Protoc,2011,6(2):242?251.

[21]LiMZ,Elledge SJ.Harnessing homologous recombinationin vitroto generate recombinant DNA via SLIC.NatMethods,2007,4(3):251?256.

[22]Ma S,Tang N,Tian J.DNA synthesis,assembly and applications in synthetic biology.Curr Opin Chem Biol,2012.

[23]Gibson DG,Young L,Chuang RY,et al.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.Nat Methods,2009,6(5):343?345.

[24]Du J,Yuan Y,Si T,et al.Customized optimization of metabolic pathways by combinatorial transcriptional engineering.Nucleic Acids Res,2012,40(18):e142.

[25]Ramon A,Smith HO.Single-step linker-based combinatorialassembly of promoterand gene cassettes for pathway engineering.Biotechnol Lett,2011,33(3):549?555.

[26]Quan J,Tian J.Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways.PLoS ONE,2009,4(7):e6441.

[27]Wingler LM, Cornish VW. Reiterative Recombination for thein vivoassembly of libraries of multigene pathways.Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(37):15135?15140.

[28]Jin YS,Stephanopoulos G.Multi-dimensional gene target search for improving lycopene biosynthesis inEscherichiacoli.Metab Eng,2007,9(4):337?347.

[29]Alper H,Stephanopoulos G.Global transcription machinery engineering:A new approach for improving cellular phenotype.Metab Eng,2007,9(3):258?267.

[30]Alper H,Moxley J,Nevoigt E,et al.Engineering yeast transcription machinery for improved ethanol tolerance and production. Science, 2006,314(5805):1565?1568.

[31]Warner JR,Reeder PJ,Karimpour-Fard A,et al.Rapid profiling of a microbial genome using mixtures of barcoded oligonucleotides. Nat Biotechnol,2010,28(8):856?862.

[32]Wang HH,Isaacs FJ,Carr PA,et al.Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution.Nature,2009,460(7257):894?898.

[33]Isaacs FJ,Carr PA,Wang HH,et al.Precise manipulation of chromosomes in vivo enables genome-wide codon replacement.Science,2011,333(6040):348?353.

[34]Sandoval NR,Kim JY,Glebes TY,et al.Strategy for directing combinatorial genome engineering inEscherichia coli.Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(26):10540?10545.

[35]NaD,Yoo SM,Chung H,etal.Metabolic engineering ofEscherichia coliusing synthetic small regulatory RNAs.Nat Biotechnol,2013,31(2):170?174.

[36]Jiang W,Bikard D,Cox D,et al.RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.Nat Biotechnol,2013,31(3):233?239.

[37]Cong L,Ran FA,Cox D,et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science,2013,339(6121):819?823.

[38]Charpentier E, Doudna JA. Biotechnology:Rewriting a genome.Nature,2013,495(7439):50?51.

[39]Qi LS,Larson MH,Gilbert LA,et al.Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.Cell,2013,152(5):1173?1183.