朱彥博，唐葉玲，陳圣豐，吳海武，郭偉良，馮永勤，王世鋒，周永燦，謝珍玉

(海南大學(xué) 海南省水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南大學(xué) 海洋學(xué)院，海南 ?？?570228)

目前，由于地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)能產(chǎn)生多種具有重要生物活性的胞外產(chǎn)物，如肽類或非肽類的抗菌物、小分子活性物質(zhì)及多種胞外消化酶［1］，因此，它可促進(jìn)養(yǎng)殖水體的營養(yǎng)循環(huán)，從而凈化水質(zhì)［2-4］，有效避免了化學(xué)藥物的濫用［5-7］，同時還能增強(qiáng)動物的免疫反應(yīng)，提高養(yǎng)殖生物的消化機(jī)能［8-14］，所以地衣芽孢桿菌已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中.然而，在凈化水質(zhì)的實(shí)際應(yīng)用中，該菌的生長、產(chǎn)酶能力以及胞外產(chǎn)物的活性均會受到復(fù)雜的水質(zhì)環(huán)境因子的影響［15］.為了有效評估培養(yǎng)條件對菌株培養(yǎng)液中蛋白酶活性(包括產(chǎn)酶能力和酶活)的綜合影響，筆者引入了“相對蛋白酶活性”，它是指菌株培養(yǎng)液中的蛋白酶活相對于最佳培養(yǎng)條件下的蛋白酶K 的酶活的大小，同時測定了鹽度、溫度和pH 值3 個主要水質(zhì)環(huán)境因子對分離自海南海水養(yǎng)殖系統(tǒng)的地衣芽胞桿菌(Pb-WC09001、Pb-WC09002)相對蛋白酶活性的影響，以期在海南水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中應(yīng)用這2 個菌株提供指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種野生型熱帶地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)Pb-WC09001、Pb-WC09002，由本實(shí)驗(yàn)室從海南省文昌市的養(yǎng)殖水體中分離、篩選和保存，這2 個菌株表現(xiàn)出較高的蛋白酶活性.

1.1.2 培養(yǎng)基普通海水液體培養(yǎng)基:酵母浸膏1 g·L-1，牛肉膏3 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1，NaCl 30 g·L-1，pH7.5.脫脂牛奶培養(yǎng)基:參考陳圣豐等［16］的方法制備.

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將蛋白酶K(北京全式金生物技術(shù)有限公司，50 U·mg-1)稀釋為80，40，20，10，5，對應(yīng)的酶活分別為80×10-3，40×10-3，20×10-3，10×10-3mg·L-1，5×10-3U·mL-1(最適孵育溫度為58 ℃).分別將20 μL 加入d=4 mm 的脫脂牛奶培養(yǎng)基平板的孵育孔內(nèi)，用封口膠將平板封閉，保持濕度，置于30 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，測量其蛋白酶水解圈直徑，然后建立蛋白酶水解圈直徑(X 軸)與酶活(Y 軸)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于本試驗(yàn)中菌體上清液的蛋白酶水解圈直徑換算為最適條件下的蛋白酶K蛋白酶活性.

1.2.2 鹽度對菌株相對蛋白酶活性的影響將2 株高蛋白酶活地衣芽孢桿菌分別接種于不同鹽度(0，10，20，30，40，50)的50 mL 滅菌的普通海水液體培養(yǎng)基中，接種菌落濃度為2×103/mL(下同)，30 ℃150 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，按照陳圣豐等［16］的方法制備上清液(下同).

按上法將2 株細(xì)菌在不同鹽度下培養(yǎng)的上清液分別加入其對應(yīng)鹽度的脫脂奶平板孵育孔中，30 ℃孵育24 h，觀察和記錄結(jié)果，并將各孔的蛋白酶水解圈直徑換算為最適條件下的蛋白酶K 活性.試驗(yàn)設(shè)置3個平行組.

1.2.3 溫度對菌株相對蛋白酶活性的影響將菌株分別接種于6 瓶已滅菌的50 mL 普通海水液體培養(yǎng)基中，分別置于6 個溫度為18，22，26，30，34，38 ℃的培養(yǎng)箱中，150 r·min-1培養(yǎng)24 h，并制備成上清液.

試驗(yàn)組1:在上述6 個溫度梯度下取2 個株菌的上清液20 μL，分別加入脫脂牛奶孵育孔內(nèi)，并置于6個不同溫度的生化培養(yǎng)箱中(各樣品均置于與培養(yǎng)時相同的溫度)孵育24 h，然后觀察和記錄結(jié)果，并計(jì)算其相對酶活性.試驗(yàn)設(shè)置3 個平行組.

試驗(yàn)組2:加樣方法與試驗(yàn)組1 相同，不同的是所有平板均置于30 ℃的生化培養(yǎng)箱中孵育24 h，然后觀察和記錄結(jié)果，并計(jì)算其相對酶活性.試驗(yàn)設(shè)置3 個平行組.

1.2.4 pH 對菌株相對蛋白酶活性的影響配制pH 為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0 共7 份不同的普通海水液體培養(yǎng)基，每份50 mL，分別接種Pb-WC09001 和Pb-WC09002 后，30 ℃180 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h，然后測定不同菌液的上清液的水解圈直徑，并計(jì)算其相對酶活.

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 不同質(zhì)量濃度的蛋白酶K 的水解圈直徑在(6.30±0.06)mm～(16.32±0.08)mm 之間(見表1)，與廠家標(biāo)明的酶活(最適條件下)存在明顯的線性關(guān)系，即y=4.826 9x-4.757 6，R2=0.984 9(見圖1).因此，蛋白酶的水解圈直徑與其相對酶活(相對于最適條件下的蛋白酶K)存在良好的線性關(guān)系.

表1 不同質(zhì)量濃度的蛋白酶K 水解圈直徑及酶活

圖1 蛋白酶K 水解圈直徑與酶活性的線性關(guān)系

2.2 鹽度對相對蛋白酶活性的影響 除Pb-WC09002 在鹽度為30 時的相對酶活性略大于其在鹽度為20 時的相對酶活性外，總體而言，2 株細(xì)菌的相對蛋白酶活性隨鹽度的增加而逐漸減弱(見表2):在鹽度為0(即淡水)時，相對酶活性最高，分別為3.2 U·mL-1(Pb-WC09001)和3.19 U·mL-1(Pb-WC09002);在鹽度為50 時，僅Pb-WC09001 存在一定的酶活性，相對酶活為1.56 U·mL-1，而Pb-WC09002 完全喪失酶活性.

表2 鹽度對菌株P(guān)b-WC09001 和Pb-WC09002 相對蛋白酶活性的影響

2.3 溫度對相對蛋白酶活性的影響 試驗(yàn)組1∶Pb-WC09001 的蛋白酶活性隨溫度的升高而逐漸升高，在34 ℃時酶活性最高，相對酶活為3.77 U·mL-1，38 ℃時的酶活性略低于34 ℃時，相對酶活為3.75 U·mL-1;Pb-WC09002 的蛋白酶活性在22 ℃時最低，相對酶活為2.22 U·mL-1，34 ℃時酶活性最高，相對酶活為3.76 U·mL-1(見表3).

表3 溫度對菌株P(guān)b-WC09001 和Pb-WC09002 相對蛋白酶活性的影響(Ⅰ)

試驗(yàn)組2:在30 ℃孵育條件下，Pb-WC09001 在22 ℃培養(yǎng)時所獲得的上清液的相對酶活性最高，為2.46 U·mL-1，26 ℃時最低，僅為1.33 U·mL-1;Pb-WC09002 在30 ℃培養(yǎng)時所獲得的上清液的相對酶活性最高，為2.74 U·mL-1，在38 ℃時水解圈直徑為0，即沒有酶活(見表4).

表4 溫度對菌株P(guān)b-WC09001 和Pb-WC09002 相對蛋白酶活性的影響(Ⅱ)

2.4 pH 值對相對蛋白酶活性的影響 pH 值對2 株細(xì)菌的酶活性存在明顯的影響，pH8.0 時，Pb-WC09001 的上清液的相對酶活性最高，為2.74 U·mL-1，pH6.0 時最低，僅為1.53U·mL-1;pH7.5 時，Pb-WC09002 的上清液的相對酶活性最高，為2.74 U·mL-1，pH9.0 時最低，為0(見表5).

表5 pH 對菌株P(guān)b-WC09001 和Pb-WC09002 相對蛋白酶活性的影響

3 討論

地衣芽孢桿菌能分泌多種高活性的胞外消化酶，主要有蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等水解酶和一些分解植物性餌料中非淀粉多糖的酶類，如果膠酶、葡聚糖酶、纖維素酶等［1，17-18］，可將水體中的蛋白質(zhì)、多糖等高聚物變成有利于被其他生物吸收利用的小分子物質(zhì)［19］，常表現(xiàn)出較好的水質(zhì)凈化作用.SOGARRD等［13］也曾報(bào)道:地衣芽孢桿菌胞外酶可以降解果膠等某些復(fù)雜的植物性碳水化合物.然而在實(shí)際應(yīng)用中，菌體在水體中的生長、產(chǎn)酶活性及其胞外酶活性都會受到鹽度、溫度和pH 值等多種水質(zhì)因子的影響.在本試驗(yàn)中，雖然Pb-WC09002 在鹽度為30 時的酶活高于鹽度為20 時的酶活，但總體而言，低鹽度下的蛋白酶活性高于高鹽度下的酶活，表明鹽度對該菌的胞外蛋白酶活具有抑制作用，與謝航等［20］的研究結(jié)果基本一致.這可能是由于鹽度改變了細(xì)菌培養(yǎng)液的滲透壓，從而影響細(xì)菌蛋白酶的表達(dá)或釋放，也可能通過影響酶本身的活性而使菌株的表觀酶活下降.溫度也明顯影響地衣芽孢桿菌的相對蛋白酶活性.試驗(yàn)組Ⅰ的結(jié)果表明，盡管Pb-WC09002 的蛋白酶活性存在一定的波動性，但是，在不同培養(yǎng)溫度下，隨著溫度的升高，Pb-WC09001 和Pb-WC09002 的蛋白酶活的總體趨勢表現(xiàn)為逐步增高，因此，培養(yǎng)溫度對這2株細(xì)菌的酶活力起促進(jìn)作用.試驗(yàn)組2 的結(jié)果表明，同一菌株在不同培養(yǎng)溫度下獲得的上清液酶活不同，不同菌株在38 ℃的上清液在30 ℃孵育溫度下的酶活差異較大，Pb-WC09002 在38 ℃下獲得的上清液在30 ℃孵育溫度下基本不表現(xiàn)蛋白酶活，而Pb-WC09001 在38 ℃下獲得的上清液在30 ℃孵育溫度下表現(xiàn)較強(qiáng)蛋白酶活，這表明不同菌株在相同溫度下可產(chǎn)生不同的蛋白酶.無論是在低鹽度條件下，還是在低溫條件下，Pb-WC09002 的相對酶活性總體上均高于Pb-WC09001.海南島沿岸水溫在秋季和冬季較低，平均水溫分別為23.22 ℃和18.5 ℃［21］，秋季(9～10 月份)受降雨量的影響，鹽度普遍降低，有些海域，如英潮港，鹽度最低時只有12［22］，因此，Pb-WC09002 更適應(yīng)于水溫和鹽度均較低的季節(jié).到了春末和夏季，海水溫度普遍升高，鹽度也增高，東海岸的清瀾港鹽度高達(dá)34.47，西海岸的東方和鶯歌海分別高達(dá)36.0和36.2［21］，相對于Pb-WC09002，Pb-WC09001 更適應(yīng)于這些季節(jié).

pH 值也能明顯影響地衣芽孢桿菌胞外蛋白酶的活力.不同菌株在相同pH 值條件下，蛋白酶活性存在顯著差異.pH8.0 時，Pb-WC09001 的酶活性最高，而Pb-WC09002 的酶活卻低于pH7.5 時，pH 9.0 時，Pb-WC09001 的相對酶活為1.56U·mL-1，而Pb-WC09002 的蛋白酶沒有活性，表明Pb-WC09001 對海水環(huán)境(pH8.0～8.4)的適應(yīng)性更高.曹煜成等［15］的研究表明，該菌的蛋白酶水解最適pH 為6.0～9.0，pH9.0 時酶活性最高，彭勇等［23］認(rèn)為地衣芽孢桿菌胞外蛋白酶的最適pH 為8.0～12.0，在pH 為10.5 時酶活性最高，袁鑄等［24］和黃紅英等［25］則認(rèn)為，其最適pH 為7.0～11.0，最大酶活力出現(xiàn)在pH 為9.0.這可能是因?yàn)樵撗芯糠謩e涉及了不同的地衣芽胞桿菌菌株，而不同菌株的最適pH 值存在差異的緣故，因此，在今后的相關(guān)研究中，應(yīng)對不同的野生型地衣芽孢桿菌開展其最適環(huán)境因子的研究;同時，由于長期的進(jìn)化，地衣芽孢桿菌很可能存在不同的地理種群，只有本地菌株才能更好地適應(yīng)當(dāng)?shù)氐乃|(zhì)環(huán)境因子.

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