胡衛(wèi)華，侯文文，吳滿意，嚴(yán)永旭

(皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，安徽 蕪湖 241001)

目前，質(zhì)量控制體系(quality control system，QC)已廣泛地應(yīng)用于各種類型的實驗室管理及質(zhì)量控制中［1］。生殖醫(yī)學(xué)中心胚胎實驗室是人類胚胎的加工廠，是人類輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)順利開展極為重要的核心部分［2］。在開展人類ART 技術(shù)前，質(zhì)量控制實驗-鼠胚實驗(mouse embryo assay，MEA)是目前最常用于生殖醫(yī)學(xué)中心胚胎培養(yǎng)室的生物學(xué)監(jiān)控方法，適用于新建體外受精(in vitro fertilization，IVF)胚胎培養(yǎng)室的質(zhì)量控制［3］。我院生殖醫(yī)學(xué)中心于2012年4月建成IVF 胚胎培養(yǎng)室。前期對培養(yǎng)室進(jìn)行“熱處理”后［4］，于2012年7～12月間在人IVF 技術(shù)條件下對昆明系小白鼠進(jìn)行體外受精鼠胚和體內(nèi)受精鼠胚(取原核胚)進(jìn)行培養(yǎng)觀察研究，并對比分析了兩組體內(nèi)外受精胚的受精率、卵裂率、囊胚形成率，旨在對新建胚胎培養(yǎng)室進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控，對技術(shù)員操作水平進(jìn)行訓(xùn)練和評估，為開展人類胚胎體外培養(yǎng)提供可靠的實驗依據(jù)和質(zhì)量控制保證。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 4～6 周齡以上雌性昆明系小白鼠(體質(zhì)量30～35 g);6～8 周齡以上雄性昆明系小白鼠(體質(zhì)量40～45 g)，購自皖南醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)3～5 d 后進(jìn)行實驗。

1.1.2 藥物與試劑 馬血清促性腺激素(PMSG)購自天津華孚生物技術(shù)公司，人絨毛膜促性腺激素(HCG)為中國麗珠制藥生產(chǎn)。采用SAGE QUINN'S ADVANTAGETM 序貫培養(yǎng)液:HEPES 緩沖的HTF操作液(1023)、第三代HTF 培養(yǎng)液(1020)、卵裂培養(yǎng)液(1026)、囊胚培養(yǎng)液(1029)、血清蛋白代用品(SPS 3010)、組織培養(yǎng)油(4008P)等。培養(yǎng)液均于使用前一天下午下班前配制好后，置37 ℃、5.5%CO2、90%以上的濕度培養(yǎng)箱中平衡過夜。

1.1.3 耗材與設(shè)備 培養(yǎng)皿、試管、巴斯德管等耗材均為美國FALCON 公司產(chǎn)品，一次性使用。CO2氣體純度為99.995%，美國THERMO 3111 培養(yǎng)箱、日本SANYO 二氣培養(yǎng)箱及日本ASTEC 三氣培養(yǎng)箱、NIKON 解剖顯微鏡、NIKON 倒置顯微鏡、丹麥ORIGIO 1800 恒溫百級工作站、德國LABOTECT CO2濃度檢測儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 鼠精的采集和獲能 頸椎脫臼法處死雄鼠，在無菌條件下取附睪尾放入QUINN'S 1020 +10%SPS 液中，用一次性1 ml 注射器小心刺破輸精管，輕輕擠壓出精子，收集精子懸液置盛有QUINN'S 1020+10% SPS 的FALCON 錐形離心管中，放入37 ℃、5.5%CO2、90%以上濕度的培養(yǎng)箱中獲能并直接上游30～60 min。

1.2.2 小鼠超排卵和鼠卵采集 每只雌鼠行腹部消毒后腹腔內(nèi)注射孕馬血清(PMSG)10 IU，48 h 后腹腔內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)10 IU，16 h后頸椎脫臼法處死雌鼠，無菌條件下取出膨大的輸卵管，放入盛有QUINN'S 1023 +10%SPS 的培養(yǎng)皿中，用一次性1 ml 注射器刺破輸卵管膨大部，將卵團(tuán)及卵子收集到500 μl QUINN'S 1020 +10%SPS 受精皿中，放入37 ℃、5.5%CO2、90%以上濕度的培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.3 體外受精 采用集中受精法(3037 皿，加油覆蓋)。待精子獲能并上游后在顯微鏡下觀察其活力及濃度，吸取精子懸液到含有卵子的培養(yǎng)液中，使終濃度為(1～2)×106/ml，放入37 ℃、5.5% CO2、90%以上濕度的培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.4 原核胚及卵裂期胚胎的觀察與培養(yǎng) D0:受精6 h 后觀察原核胚(出現(xiàn)2 原核為受精成功標(biāo)志)，在QUINN'S 1026 +10%SPS 培養(yǎng)液滴中輕輕吹洗后轉(zhuǎn)至新的已平衡好的QUINN'S 1026 +10%SPS 培養(yǎng)液微滴中，每微滴20 μl，放入5～10 枚原核胚，重新置入37 ℃、5.5%CO2、90%以上濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng);D1:受精16～18 h 后觀察鼠胚2-細(xì)胞的發(fā)育情況;D2:觀察4 細(xì)胞期鼠胚的發(fā)育情況;D3:觀察8 細(xì)胞期鼠胚發(fā)育情況，之后移入已平衡好的QUINN'S 1029 囊胚培養(yǎng)液中序貫培養(yǎng);D4:觀察桑椹期鼠胚及早期囊胚形成情況;D5～D6:觀察囊胚期鼠胚及其孵出情況。

1.2.5 小鼠超排卵和原核胚的采集 雌鼠腹腔注射PMSG 10 IU，48 h 后每只雌鼠腹腔注射10 IU HCG，當(dāng)晚雌雄鼠(1∶1)合籠(注:3 d 內(nèi)交配過或1周以上交配過的雄鼠不用)，第2 天早晨查陰道栓，將明確有陰道栓的孕鼠頸椎脫臼法處死，無菌條件下解剖并取出輸卵管放于1020 培養(yǎng)液中，在IVF 工作站解剖顯微鏡下，37 ℃熱平臺上用1 ml 注射器針頭刺破輸卵管膨脹部，原核胚及卵自動流出或輕輕擠出，用拉細(xì)的無菌巴氏德管收集原核胚，放置已平衡過夜的1026 培養(yǎng)微滴中，每微滴20 μl，放入5～10 枚原核胚。序貫培養(yǎng)觀察鼠胚的發(fā)育情況至囊胚形成至孵出(觀察方法同體外受精，見1.2.4)。

1.3 數(shù)據(jù)處理 兩組胚胎不同時期的發(fā)育情況比較采用兩組間χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 昆明系白鼠體外受精的結(jié)果 嚴(yán)格按照人IVF 實驗條件的要求，在新建人IVF 胚胎實驗室條件下，給24 只昆明系小白鼠進(jìn)行了24 個IVF 周期，累積獲卵938 枚，原核受精胚843 個，受精率為89.87%;2-細(xì)胞胚胎數(shù)789 個，卵裂率96.32%，卵裂后形成早期囊胚760 個，囊胚形成率為95.39%，實驗結(jié)果見表1。

2.2 昆明系白鼠體內(nèi)受精體外培養(yǎng)結(jié)果 在新建人IVF 胚胎實驗室條件下，共進(jìn)行了24 個周期原核胚收集，累積獲卵916 枚，原核受精胚882 個，受精率96.29%;2-細(xì)胞胚胎859 個，卵裂率97.21%，卵裂后形成早期囊胚835 個，囊胚形成率為93.57%，實驗結(jié)果見表2。

2.3 鼠胚實驗在原核受精胚后體外發(fā)育情況比較體內(nèi)受精后獲得的受精率為96.29%，2-細(xì)胞數(shù)859 個;與體外IVF 組獲得的受精率為89.87%，2-細(xì)胞數(shù)789 個;兩組經(jīng)卡方檢驗，均P ＜0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義。而卵裂率及囊胚形成率兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。實驗結(jié)果見表3。

表1 昆明系小白鼠體外IVF 實驗結(jié)果(%)Tab 1 Experimental results of in vitro fertilization in mice of Kunming species(%)

表2 昆明小白鼠體內(nèi)受精體外培養(yǎng)實驗結(jié)果(%)Tab 2 Experimental results of in vivo fertilization in mice of Kunming species(%)

表3 不同來源昆明系小白鼠的2-細(xì)胞胚胎體外發(fā)育情況比較Tab 3 Comparison of the development frequencies of 2-cells in vitro fertilization embryo from different mouse sources of Kunming species

3 討論

胚胎實驗室是人類輔助生殖技術(shù)實施的重要支撐點，是保證ART 成功的重要核心條件。鼠胚實驗分析(MEA)適用于新建或新啟動周期的IVF 實驗室質(zhì)控［5］。通過動態(tài)觀察小鼠胚胎發(fā)育情況，了解囊胚形成率及孵出等，在反映胚胎發(fā)育狀況的同時，可監(jiān)測胚胎實驗室的各種因素，包括空氣質(zhì)量、溫度、濕度以及各種耗材、培養(yǎng)液、培養(yǎng)箱、CO2氣體和技術(shù)人員操作水平等［6］。

我們的實驗結(jié)果表明，小鼠體內(nèi)或者體外IVF獲得的原核受精胚，皆能在胚胎培養(yǎng)室二氣或者三氣培養(yǎng)箱中發(fā)育至囊胚階段，而且發(fā)育狀況良好，符合MEA 的質(zhì)控要求，各項指標(biāo)均達(dá)到質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)［7－8］。而且，實驗結(jié)果還表明，小鼠自然合籠體內(nèi)受精后獲得原核受精胚數(shù)量多，受精率和2-細(xì)胞率高于小鼠體外IVF 結(jié)果為96.29%和97.39%，受精率穩(wěn)定在93.91%以上?？紤]小鼠體外IVF 受諸多因素影響，如:不同批次的小鼠其雌鼠和雄鼠狀態(tài)不一，對環(huán)境適應(yīng)亦存在個體差異。有時雄鼠精子從附睪釋出后，觀察其精子的存活時間相差懸殊，即可影響受精率［9－10］。除此之外，實驗中我們發(fā)現(xiàn):同批次昆明系小白鼠，同樣的培養(yǎng)環(huán)境，同樣批號的試劑、藥品等，由不同的實驗員同方法同時進(jìn)行操作，其受精率也會產(chǎn)生差別，故認(rèn)為不同的技術(shù)水平的實驗員，操作技術(shù)的嫻熟程度不一，配子及胚胎在培養(yǎng)箱外的暴露時間長短不一，可得到有差異的實驗結(jié)果［11］。之后隨著胚胎實驗室操作人員的技術(shù)日益嫻熟，小鼠體外IVF 的受精率逐步提高，最后亦能達(dá)到90%以上。因此，我們認(rèn)為體內(nèi)受精法采集2-細(xì)胞胚胎，該方法雖穩(wěn)定簡單，但其不能良好地評價配子及受精卵對培養(yǎng)用品的敏感性，不能對體外受精的整個過程和實驗操作人員進(jìn)行全面評價［12－13］。所以，我們將兩種方法結(jié)合，對胚胎實驗室進(jìn)行了全面的質(zhì)量控制，得到了較好的結(jié)果，受精率、卵裂率、囊胚形成率等，各項指標(biāo)均符合輔助生殖實驗室質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)［14］。

4 結(jié)論

質(zhì)量控制在體外受精(IVF)及胚胎培養(yǎng)過程中至關(guān)重要［15－16］。在新的胚胎實驗室啟用前，我們進(jìn)行必要的通風(fēng)散氣以及熱處理后，再給予無毒的吸附炭包凈化室內(nèi)環(huán)境之后，我們用二氧化碳檢測儀校驗培養(yǎng)箱、空氣培養(yǎng)監(jiān)測空氣質(zhì)量等。這些措施較好保證了我們良好的實驗結(jié)果。因此，我們建議使用小鼠體內(nèi)受精和體外IVF 這兩種方法獲得雙原核受精胚作為實驗室培養(yǎng)體系監(jiān)測評價指標(biāo)，特別是對于新建的胚胎培養(yǎng)實驗室，在質(zhì)控的同時促使實驗操作人員熟練IVF 全過程，以確保ART 的核心部分-胚胎實驗室安全穩(wěn)定地運行，從而確保為臨床提供更多優(yōu)質(zhì)胚胎。

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