劉 倩， 陳龍龍， 張祖艷， 李云華， 謝天培*

(1.上海滬豐生物科技有限公司，上海 200433;2.上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，上海 201203)

馬兜鈴酸 (aristolochic acid)為硝基菲類化合物，主要存在于馬兜鈴屬和細(xì)辛屬植物中。這兩屬植物在中藥中應(yīng)用廣泛。近年來，大量文獻(xiàn)報(bào)道了馬兜鈴酸的腎毒性及致癌致突變作用，引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視［1-4］。但含馬兜鈴酸的中藥近年來在某些地區(qū)臨床上仍然大量使用［5-6］。研究發(fā)現(xiàn)，馬兜鈴酸-DNA加合物的形成是馬兜鈴酸致癌及致突變的重要原因［7-9］，可能也參與了馬兜鈴酸腎病的發(fā)病過程［10］。Chen等［11］通過在臺(tái)灣進(jìn)行的以馬兜鈴酸-DNA加合物和TP53突變譜為生物標(biāo)志物的分子流行病學(xué)調(diào)查認(rèn)為馬兜鈴酸暴露是導(dǎo)致上尿路上皮癌發(fā)生的重要原因。馬兜鈴酸-DNA加合物現(xiàn)已被用作檢測馬兜鈴酸中毒的生物標(biāo)記物。馬兜鈴酸-DNA加合物對(duì)于深入研究馬兜鈴酸的致癌及致突變性具有重要作用。對(duì)于臨床疾病的防治工作具有重要意義。

馬兜鈴酸-DNA加合物在體內(nèi)含有量極微，體外制備反應(yīng)產(chǎn)率低，純化困難［12］。馬兜鈴酸-DNA加合物的檢測方法有32P-后標(biāo)記法及質(zhì)譜法等。32P-后標(biāo)記法步驟較繁瑣，不能提供加合物結(jié)構(gòu)信息，穩(wěn)定性差，不同實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果差異很大。而液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 (LC-MS)既能夠檢測加合物，還能提供結(jié)構(gòu)信息，已被用于馬兜鈴酸-DNA加合物分析中［12-14］。Yun 等［15］指出 UPLC-ESI/MS 法是一種靈敏度高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)健的分析方法，可以替代現(xiàn)行的對(duì)人體組織中DNA加合物進(jìn)行生物監(jiān)測的32P后標(biāo)記技術(shù)。馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ是馬兜鈴酸類化合物的主要毒性成分。本研究通過體外合成馬兜鈴酸Ⅰ-DNA加合物，優(yōu)化反應(yīng)條件，UPLC-ESI/MS法對(duì)馬兜鈴酸Ⅰ-DNA加合物進(jìn)行分析研究。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent 1290超高效液相-G6460三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀;渦旋振蕩器 (Vortex-5，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司);恒溫振蕩培養(yǎng)箱 (HZQ-X100，太倉華美);離心機(jī) (TGL-16C，上海安亭科學(xué)儀器廠);超聲波清洗儀(KQ5200DB，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 馬兜鈴酸Ⅰ (上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，批號(hào):191/120416);脫氧鳥苷 (dG)、脫氧腺苷 (dA)、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、N，N-二甲基甲酰胺、鋅粉均購于美國 sigma公司;cleanert C18固相萃取柱;甲醇、乙酸為色譜純;水為超純水。

2 試驗(yàn)方法

2.1 馬兜鈴酸Ⅰ-DNA加合物的合成 取1 mg馬兜鈴酸Ⅰ，用50 μL N，N-二甲基甲酰胺 (DMF)溶解，超聲促溶，加入1 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的脫氧鳥苷 (dG)/脫氧腺苷 (dA)磷酸鉀緩沖液及10 mg鋅粉，渦旋混勻，于37℃ 恒溫振蕩16 h［10］，反應(yīng)產(chǎn)物離心 (12 000g×10 min)以除去未反應(yīng)的鋅粉。其反應(yīng)過程見圖1。反應(yīng)后上層清液過固相萃取柱，上樣后以2 mL水淋洗 (棄去)，1 mL甲醇洗脫，洗脫液過0.45 μm微孔濾膜，LCMS分析。兩個(gè)反應(yīng)均設(shè)兩個(gè)陰性對(duì)照組，即分別不添加dG/dA，同法操作。

圖1 馬兜鈴酸-DNA加合物生成過程Fig.1 Synthesis pathway of aristolochic acid-DNA adducts

2.2 不同pH值緩沖液對(duì)馬兜鈴酸Ⅰ-DNA加合物的影響

2.2.1 不同pH值磷酸鉀緩沖液的配制 稱取磷酸二氫鉀，倒入燒杯中，加入超純水溶解，移入量瓶中，定容至刻度，用50 mmol/L的磷酸氫二鉀調(diào)整pH值分別為6.4、5.8、5.2，即可。

2.2.2 馬兜鈴酸Ⅰ-dA加合物合成 按2.1頂方法。

2.3 分析條件

2.3.1 色譜條件 Agilent Zorbax Extend C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm);流動(dòng)相為0.2%乙酸-乙腈 (70∶30);體積流量0.4 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量2 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源 (ESI)，正離子掃描;根據(jù)需要分別采用全掃描、產(chǎn)物離子掃描及MRM檢測方式 (［dG-馬兜鈴酸Ⅰ:(m/z)558.4→442.6。dA-馬兜鈴酸Ⅰ:(m/z)542.8→ 426.8］;干燥氣溫度350℃;干燥氣體積流量5 L/min;霧化器壓力45psi(1psi=6.895 kPa);鞘氣溫度400℃;鞘氣體積流量11 L/min。

2.4 正交試驗(yàn) 選擇dG或dA摩爾濃度倍數(shù)(A)、加入鋅粉量 (B)、時(shí)間 (C)為考察因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，以質(zhì)譜MRM模式下dG-馬兜鈴酸Ⅰ/dA-馬兜鈴酸Ⅰ峰面積為指標(biāo)，用L9(34)正交表安排試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

2.5 馬兜鈴、青木香藥材提取物與dG或dA反應(yīng)及檢測 馬兜鈴、青木香藥材分別用甲醇提取3次，濃縮至干。按正交試驗(yàn)優(yōu)選的方法將提取物與dG或dA反應(yīng)，LC-MS檢測。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

2.6 形成DNA加合物的最低馬兜鈴酸濃度檢測將不同濃度的馬兜鈴酸按正交試驗(yàn)優(yōu)選的方法與dG/dA反應(yīng)，LC-MS檢測，確定能夠檢測到加合物的最低馬兜鈴酸濃度。

3 結(jié)果

3.1 dG-馬兜鈴酸Ⅰ、dA-馬兜鈴酸Ⅰ的質(zhì)譜行為在正離子模式下，馬兜鈴酸Ⅰ-dG、馬兜鈴酸Ⅰ-dA全掃描一級(jí)質(zhì)譜的準(zhǔn)分子離子分別為m/z558.9、542.8，與 ［M+H］+吻合。陰性對(duì)照組中未檢測到相應(yīng)加合物。

在馬兜鈴酸Ⅰ與dA的反應(yīng)體系中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)m/z為542.8的質(zhì)譜峰，在0.2%乙酸-乙腈(70∶25)條件下，保留時(shí)間分別為0.977 min、3.448 min(馬兜鈴酸Ⅰ-dAI、馬兜鈴酸Ⅰ-dAⅡ)。對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，在10、20、30、40 ev的碰撞能量 (CE)下，其質(zhì)譜行為相似 (結(jié)果見圖2-a1、a2)，推測馬兜鈴酸Ⅰ與dA反應(yīng)生成了兩種不同的加合物。二級(jí)質(zhì)譜中m/z426.3的離子為［M+H］+離子從糖苷鍵處斷裂失去脫氧核糖形成。當(dāng)CE為40 ev時(shí)m/z291.4的碎片離子為馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ與dA共價(jià)鍵連接處斷裂后馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ的碎片離子峰。其可能的碎裂方式見圖3-a。

圖2 dG-馬兜鈴酸Ⅰ、dA-馬兜鈴酸Ⅰ二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 Product ion of dG-aristolochic acidⅠ，dA-aristolochic acidⅠ

圖3 dG-馬兜鈴酸Ⅰ、dA-馬兜鈴酸Ⅰ二級(jí)質(zhì)譜碎裂方式Fig.3 Fragmentation pattern of dG-aristolochic acidⅠand dA-aristolochic acidⅠ

對(duì)馬兜鈴酸Ⅰ與dG的反應(yīng)體系中的m/z558.9準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描 (見圖2-b)，CE為20 ev時(shí)m/z442.6的碎片離子為 ［M+H］+離子從糖苷鍵處斷裂丟失脫氧核糖形成。CE為40 ev時(shí)m/z291.4的碎片離子為馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ與dA共價(jià)鍵連接處斷裂后馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ的碎片離子峰。m/z397.7為準(zhǔn)分子離子丟失脫氧核糖后丟失-NHCO-形成。m/z410.2為準(zhǔn)分子離子丟失脫氧核糖后脫去馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ上的甲氧基形成。其可能的碎裂方式見圖3-b。

3.2 不同pH值緩沖液對(duì)馬兜鈴酸Ⅰ-DNA加合物的影響 質(zhì)譜檢測模式:MRM。結(jié)果見表2。

表2 不同pH值條件下馬兜鈴酸Ⅰ-dA1、馬兜鈴酸Ⅰ-dA2峰面積Tab.2 Aera of aristolochic acidⅠ-dA1，aristolochic acidⅠ-dA2 under different pH conditions

由表1可見，pH值不同，馬兜鈴酸Ⅰ-dA1、馬兜鈴酸Ⅰ-dA2的相對(duì)峰面積也發(fā)生變化。當(dāng)pH為5.8時(shí)，兩種加合物的峰面積之和最大，因此確定反應(yīng)pH值為5.8。

3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 見表3～6。對(duì)表3～4數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。直觀分析表明，以馬兜鈴酸Ⅰ-dG峰面積為指標(biāo)，最佳條件為A3B1C3，極差分析表明，各因素的影響從大到小依次為為A、C、B。方差分析表明，三個(gè)因素對(duì)結(jié)果均無顯著性影響，綜合上述分析及經(jīng)濟(jì)成本，確定方案A3B1C3為最佳條件，即用相當(dāng)于馬兜鈴酸Ⅰ3倍量的脫氧鳥苷，10倍鋅粉，反應(yīng)時(shí)間為24 h。

表3 馬兜鈴酸Ⅰ與脫氧鳥苷加合L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Aristolochic acidⅠ-dG L9(34)design and results of orthogonal test

表4 馬兜鈴酸Ⅰ-脫氧鳥苷峰面積方差分析Tab.4 Aera variance analysis of aristolochic acidⅠ-dG

表5 馬兜鈴酸Ⅰ與脫氧腺苷加合L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.5 Aristolochic acidⅠ-dA L9(34)design and results of orthogonal test

表6 馬兜鈴酸Ⅰ-脫氧腺苷峰面積之和的方差分析Tab.6 Aera variance analysis of aristolochic acidⅠ-dA

對(duì)表5～6數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。直觀分析表明，以馬兜鈴酸Ⅰ-dA峰面積之和為指標(biāo)，最佳條件為A3B2C1，極差分析表明，各因素的影響從大到小依次為為A、C、B。方差分析表明，A因素即脫氧腺苷的加入量對(duì)結(jié)果有顯著性影響，因此確定方案A3B2C1為最佳條件，即用相當(dāng)于馬兜鈴酸Ⅰ3倍量的脫氧腺苷，20倍鋅粉，反應(yīng)時(shí)間為16 h。

3.4 馬兜鈴、青木香藥材提取物加合物檢測 在馬兜鈴、青木香藥材提取物與dG/dA的反應(yīng)體系中分別檢測到馬兜鈴酸Ⅰ-dG及馬兜鈴酸Ⅰ-dA加合物。另外還分別檢測到m/z528.6、512.4的離子。對(duì)其進(jìn)行產(chǎn)物離子掃描。結(jié)果見圖4。其質(zhì)譜行為與文獻(xiàn) ［10-11］相似，推測分別為馬兜鈴酸Ⅱ-dG及馬兜鈴酸Ⅱ-dA。

3.5 最低馬兜鈴酸質(zhì)量濃度檢測 能夠檢測到馬兜鈴酸Ⅰ-dA加合物的參加反應(yīng)的馬兜鈴酸最低質(zhì)量濃度為40 μg/mL，能夠檢測到馬兜鈴酸Ⅰ-dG，加合物的參加反應(yīng)的馬兜鈴酸最低質(zhì)量濃度為300 μg/mL。

4 討論

在馬兜鈴酸Ⅰ與dA的反應(yīng)體系中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)m/z為542.8的質(zhì)譜峰，質(zhì)譜行為相同，保留時(shí)間不同，推測馬兜鈴酸Ⅰ與dA、鋅粉反應(yīng)生成兩種加合物。目前未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

用不同pH值緩沖液配制dA、dG對(duì)馬兜鈴酸Ⅰ-dA加合物生成情況有比較明顯的影響。而且pH值不同，生成的馬兜鈴酸Ⅰ-dA1、馬兜鈴酸Ⅰ-dA2的相對(duì)量也不同。其原因尚待進(jìn)一步分析。

在反應(yīng)體系中檢測到m/z為294.0、309.9的離子。m/z294.0離子的產(chǎn)物離子為m/z279.0、251.0、221.0，m/z309.9離子的產(chǎn)物離子為m/z294.6、238.9、210.8，推測分別為反應(yīng)的兩個(gè)副產(chǎn)物:馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ及7-羥基馬兜鈴內(nèi)酰胺I的準(zhǔn)分子離子。

馬兜鈴酸Ⅰ、Ⅱ要先被酶或鋅粉還原成馬兜鈴內(nèi)酰胺鎓離子才能與dG或dA反應(yīng)形成加合物。正交試驗(yàn)選擇了可能影響反應(yīng)的3個(gè)主要因素即dG或dA濃度、加入鋅粉量、時(shí)間為考察因素，據(jù)此來優(yōu)選反應(yīng)條件。

在正交試驗(yàn)中曾以馬兜鈴酸Ⅰ-dG或dA與主要副產(chǎn)物—馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ峰面積 (MRM模式)之比為指標(biāo)進(jìn)行考察，其結(jié)果與單純用馬兜鈴酸Ⅰ-dG或dA峰面積相比趨勢(shì)相同。

圖4 馬兜鈴酸Ⅱ-dG、馬兜鈴酸Ⅱ-dA的產(chǎn)物離子掃描圖Fig.4 Product ion of aristolochic acidⅡ-dG，aristolochic acidⅡ-dA

能夠檢測到馬兜鈴酸Ⅰ-dA加合物的參加反應(yīng)的馬兜鈴酸最低質(zhì)量濃度比能夠檢測到馬兜鈴酸Ⅰ-dG加合物的參加反應(yīng)的馬兜鈴酸最低質(zhì)量濃度低很多，說明前者反應(yīng)體系更易生成加合物。

按照優(yōu)選的條件將馬兜鈴、青木香藥材提取物與dG或dA加合，能夠檢測到馬兜鈴酸Ⅰ-dA1、馬兜鈴酸Ⅰ-dA2、馬兜鈴酸Ⅰ-dG、馬兜鈴酸Ⅱ-dA、馬兜鈴酸Ⅱ-dG等加合物。目前未見相關(guān)報(bào)道。馬兜鈴酸-DNA加合物的合成及純化將在以后的工作中繼續(xù)進(jìn)行。

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