上海佰年詩丹德技術(shù)有限公司，上海 201203

馬兜鈴酸(Aristolochic acid，AA)為硝基菲類化合物，主要存在于馬兜鈴屬和細(xì)辛屬植物中。近年來，文獻報道馬兜鈴酸的腎毒性及致癌作用引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛重視[1-8]。2002年，世界衛(wèi)生組織(WHO)國際癌癥研究機構(gòu)將馬兜鈴酸列為一種潛在的致癌物質(zhì)，2012年將其列為Ⅰ類致癌物[3]。2003 年以來，我國藥品監(jiān)管部門先后取消了青木香、關(guān)木通、廣防己等含馬兜鈴酸藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并對其他含馬兜鈴酸的藥材如朱砂蓮、天仙藤、馬兜鈴、尋骨風(fēng)等采取了加強監(jiān)管、修訂說明書或質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等措施，以控制其安全性風(fēng)險。2017年10月18日《Science Translational Medicine》以封面文章的形式刊登了一篇名為“馬兜鈴酸及其衍生物與臺灣及亞洲地區(qū)肝癌廣泛相關(guān)”[9]的文章，提示馬兜鈴酸與肝癌也有很強的相關(guān)性，再次將馬兜鈴酸推至輿論的風(fēng)口浪尖。

在我國尚有含馬兜鈴酸的藥物上市銷售。對含此類成分的藥材進行合理有效的控制是保證人民用藥安全的重要手段。本文采用UPLC-MS/MS法對馬兜鈴、青木香、天仙藤、朱砂蓮、尋骨風(fēng)5種馬兜鈴屬藥材中馬兜鈴酸A、B、C、D的含量進行了測定。

1 儀器與材料

1.1 儀器 1290 超高效液相-G6460三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫科技公司)；離心機(美國賽默飛世爾科技公司)；超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 馬兜鈴酸A、B、C、D、金合歡素(純度98%以上，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司)；甲醇(HPLC級，美國賽默飛世爾科技公司) ；乙酸(HPLC級，美國西格瑪公司)；甲醇(分析純，上海泰坦科技股份有限公司)；馬兜鈴、青木香、天仙藤、朱砂蓮、尋骨風(fēng)購自各藥材公司，經(jīng)我公司劉倩博士鑒定，馬兜鈴為馬兜鈴屬北馬兜鈴(AristolochiacontortaBge)的果實，青木香為馬兜鈴科植物馬兜鈴(AristolochiadebilisSieb. et Zucc.) 的干燥根，天仙藤為北馬兜鈴(AristolochiacontortaBge.)的干燥地上部分，朱砂蓮為四川朱砂蓮 (AristolochiacinnabarinaC.Y.Cheng et J.L.Wu) 的干燥塊根，尋骨風(fēng)為馬兜鈴科植物綿毛馬兜鈴(AristolochiamollissimaHance)的地上部份。水為超純水。

表1 不同品種藥材飲片信息

表1 不同品種藥材飲片信息

2 方法與結(jié)果

2.1 分析條件 Agilent Zorbax Extend C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動相：65%甲醇-0.01%乙酸水溶液；流速：0.40 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL。電噴霧離子源(ESI)，檢測模式：正離子檢測；MRM模式：馬兜鈴酸A：m/z 359.1→298.1，定性離子對m/z 359.1→324.1；馬兜鈴酸B：m/z 329.0→268.0，定性離子對m/z 329.0→294.1；馬兜鈴酸C：m/z 345.2→282.0，定性離子對m/z 345.2→310.0；馬兜鈴酸D：m/z 375.0→312.0，定性離子對m/z 375.0→296.9；內(nèi)標(biāo)金合歡素：m/z 285.0→242.0，定性離子對：m/z 285.0→152.1，干燥氣流速：5 L/min；霧化氣壓力：45 psi；鞘氣溫度：400 ℃；鞘氣流速：11 L/min。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取馬兜鈴酸A、B、C、D對照品，加甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.12、0.11、0.13、0.12 mg/mL的對照品儲備液，4 ℃保存，備用。

2.3 內(nèi)標(biāo)溶液的制備精密稱取金合歡素對照品適量，加甲醇配制成質(zhì)量濃度為0.013 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，4 ℃保存，備用。

2.4 供試品溶液的制備 精密稱取藥材1.0 g，加入10 mL70%甲醇溶液，浸潤15 min，超聲提取30 min，3500 rpm離心10 min，分離上清液，向殘渣中加入10 mL70%甲醇溶液，超聲提取30 min，3500 rpm離心10 min，合并兩次上清液，定容于50 mL容量瓶中。取供試品溶液500 μL，加入內(nèi)標(biāo)10 μL，甲醇490 μL，混勻，0.22 μm微孔濾膜過濾。UPLC-MS/MS檢測。對照品及樣品的MRM模式圖見圖2。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系 分別精密吸取對照品儲備液5、10、20、100、500、1000 μL，加入甲醇定容至5 mL容量瓶中，搖勻，制得系列混合對照品溶液。取各濃度對照品溶液500 μL，加入內(nèi)標(biāo)10 μL，甲醇490 μL，混勻， 0.22 μm微孔濾膜過濾，UPLC-MS/MS檢測，分別以馬兜鈴酸A、B、C、D峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)對各對照品濃度(X)進行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，馬兜鈴酸A的回歸方程為y=1.5803x+0.6644，r= 0.9967，在0.06～12 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；馬兜鈴酸B的回歸方程為y= 1.4476x+0.1844，r= 0.9980，在0.055～11 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；馬兜鈴酸C的回歸方程為y= 1.4451x+0.3561，r= 0.9969，在0.065～13 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；馬兜鈴酸D的回歸方程為y=2.0126x+0.1115，r=0.9982，在0.06～12 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。按信噪比(S/N)為10計算馬兜鈴酸A、B、C、D的定量限分別為6×10-5、2.2×10-4、2.1×10-4、2.2×10-4ng，按信噪比(S/N)為3計算馬兜鈴酸A、B、C、D的檢測限分別為1.2×10-4、4.4×10-4、4.2×10-4、4.4×10-4ng。

2.5.2 精密度試驗 取馬兜鈴藥材粉末1.0 g，按照2.4 項下方法進行處理，按 2.1 項下條件測定，連續(xù)進樣測定 6 次，并記錄馬兜鈴酸A、B、C、D的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比。結(jié)果RSD分別為2.41%、2.07%、2.84%、2.71%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取2. 5. 2項下制備的供試品溶液，在0、1、2、4、8、12、24 h 按照2. 1 項下條件進行測定，記錄峰面積，以內(nèi)標(biāo)法計算馬兜鈴酸A、B、C、D的含量。結(jié)果其含量的RSD分別為3.77%、4.01%、4.39%、4.85%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗 取同一批次馬兜鈴藥材粉末 6份，按照 2.4 項下方法制備供試品溶液，并按 2.1 項下條件測定，計算馬兜鈴酸A、B、C、D的含量。結(jié)果RSD分別為2.67%、4.25%、3.13%、3.98%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2. 5. 5 加樣回收率試驗取已知含量樣品 (MDL04) 6份，精密稱取0.5 g，分別加入一定質(zhì)量的馬兜鈴酸A、B、C、D，按照2.4項下方法制備供試品溶液，按2.1項下條件進行測定，計算回收率與RSD。馬兜鈴酸A、B、C、D的加樣回收率分別為89.95%、92.06%、91.06%、92.18%，RSD分別為3.88%、3.97%、4.79%、4.76%。見表2。

2. 6 樣品測定取各藥材樣品適量，粉碎，按照2.4 項下的方法制備供試品溶液，以 2.1 項下條件進行測定，內(nèi)標(biāo)法計算中藥材中馬兜鈴酸A、B、C、D的含量，結(jié)果見表3。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)

表3 五種藥材中馬兜鈴酸A、B、C、D的含量 (n=3,μg·g-1)

續(xù)表 表3 五種藥材中馬兜鈴酸A、B、C、D的含量 (n=3,μg·g-1)

注：“-”表示未檢測到。

3 討論

2015版藥典[10]中規(guī)定，天仙藤中馬兜鈴酸A的含量不得超過0.01%，細(xì)辛中馬兜鈴酸A的含量不得超過0.001%，馬兜鈴僅作了薄層鑒別，不能有效控制藥材的質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，馬兜鈴酸-DNA加合物(AA-DNA加合物)的形成是馬兜鈴酸致癌及致突變的重要原因[11-13]，可能也參與了馬兜鈴酸腎病的發(fā)病過程[14]。本研究在對馬兜鈴、天仙藤、青木香、朱砂蓮等來源于馬兜鈴屬的藥材進行馬兜鈴酸-DNA加合物研究時發(fā)現(xiàn)，除了被廣泛研究的馬兜鈴酸A、B以外，還有一種馬兜鈴酸成分也能形成DNA加合物，即馬兜鈴酸D。在隨后進行的Ames波動試驗中發(fā)現(xiàn)，馬兜鈴酸A、B均具有致突變作用，且馬兜鈴酸B的致突變作用強于馬兜鈴酸A。另外馬兜鈴酸D也很可能是馬兜鈴酸中具有遺傳毒性的成分[15-16]。馬兜鈴酸C在該試驗中未發(fā)現(xiàn)致突變作用。

本研究對馬兜鈴屬5種藥材中馬兜鈴酸A、B、C、D的含量進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬兜鈴、青木香、天仙藤、朱砂蓮、尋骨風(fēng)中均含馬兜鈴酸A、B、C、D。馬兜鈴中馬兜鈴酸A、B、C、D的含量都比較高，其中馬兜鈴酸A的含量最高；相對于馬兜鈴酸B、C、D，青木香、尋骨風(fēng)中馬兜鈴酸A的含量較高；天仙藤中馬兜鈴酸D的含量較高，明顯高于其他四種藥材，朱砂蓮中馬兜鈴酸A、B、C、D的含量均較低。五種藥材中馬兜鈴所含四種馬兜鈴酸的總量最高。分析Ames波動試驗中呈陽性結(jié)果的馬兜鈴酸A、B、D在五種藥材中的含量，目前研究較多的馬兜鈴酸A在青木香中含量最高(最高為146.98 μg/g)，其次為馬兜鈴，尋骨風(fēng)，天仙藤、朱砂蓮中含量較低；馬兜鈴酸B在馬兜鈴、青木香的含量相對較高，但明顯低于同一藥材中馬兜鈴酸A的含量； 五種藥材中馬兜鈴酸D含量最高的是天仙藤，最高者達到161.50 μg/g，其次為馬兜鈴?？梢婑R兜鈴酸A、B、D在五種藥材中的含量有較大差別，以上結(jié)果提示我們僅檢測馬兜鈴酸A的含量是不夠的，不能保證臨床用藥安全。

實驗過程中四種馬兜鈴酸對照品的質(zhì)譜行為進行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正離子模式下，馬兜鈴酸A一級質(zhì)譜為m/z 705.1[2M+Na]+，m/z 359.1[M+NH4]+， m/z 364.1[M+Na]+，以及較低的m/z 342.1[M+H]+，產(chǎn)物離子為m/z 298.1[M+H-CO2]+，及m/z 324.1[M+H-H2O]+；馬兜鈴酸B一級質(zhì)譜為m/z 645.1[2M+Na]+，m/z 329.1[M+NH4]+，m/z 334[M+Na]+，以及較低的m/z 312.1[M+H]+，產(chǎn)物離子為m/z 267.9[M+H-CO2]+，及m/z 294.1[M+H-H2O]+，與文獻報道[17]一致；馬兜鈴酸C一級質(zhì)譜為m/z 677.0[2M+Na]+，m/z 345.2[M+NH4]+，以及較低的m/z 328.1[M+H]+，產(chǎn)物離子為m/z 282.0[M+H-CO-H2O]+，m/z 310.0[M+H-H2O]+及m/z 237.1[M+H-H2O—CO-NO2]+；馬兜鈴酸D一級質(zhì)譜為m/z 737.1[2M+Na]+，m/z 375.2[M+NH4]+，以及較低的m/z 358.1[M+H]+，產(chǎn)物離子為m/z 312.0[M+H-CO-H2O]+，m/z 296.9[M+H-CH3-NO2]+。

負(fù)離子模式下，馬兜鈴酸A一級質(zhì)譜為m/z 340.1[M-H]-，m/z 703.0[2M+Na-2H]-，產(chǎn)物離子為m/z 266.0，為[M-H]-脫掉CO2及甲氧基得到的離子；馬兜鈴酸B一級質(zhì)譜為m/z 310.2[M-H]-，m/z 643.2[2M+Na-2H]-，產(chǎn)物離子為m/z 265.7[M-H-CO2]-；馬兜鈴酸C一級質(zhì)譜為m/z 326.2[M-H]-，m/z 653.2[2M-H]-，產(chǎn)物離子為m/z 235.9[M-H--H2O-CO-NO2]-；馬兜鈴酸D一級質(zhì)譜為m/z 356.1[M-H]-，m/z 713.1[2M-H]-，產(chǎn)物離子為m/z 266.1[M-H--H2O-CO-NO2]-,及 m/z 235.9，為m/z 266.1脫掉甲氧基得到的離子。

馬兜鈴酸A、B、C、D在正負(fù)離子模式下均有響應(yīng)。其中馬兜鈴酸A、B在正離子模式下響應(yīng)較高，馬兜鈴酸C、D在負(fù)離子模式下響應(yīng)相對較高，這是由于在馬兜鈴酸C、D結(jié)構(gòu)中引入了羥基，使得它們在負(fù)離子模式下有更好的響應(yīng)。由于在檢測中對質(zhì)譜進行正負(fù)離子切換會降低靈敏度，且對儀器損耗較大，而馬兜鈴酸C、D在正離子模式下也有較好的響應(yīng)，因此選擇采用正離子模式檢測。

近年來，馬兜鈴酸類成分的安全性受到廣泛關(guān)注。李功勛等[18]利用UPLC-QQQ-MS對不同種類藥材中馬兜鈴酸Ⅰ的含量進行了測定，但只測定了一種成分含量，不能有效控制藥材質(zhì)量；路軍章等[19]建立HPLC-MS同時檢測馬兜鈴中6種馬兜鈴酸類成分的方法，質(zhì)譜采用ESI負(fù)離子模式和選擇性離子掃描(SIM)，檢測時間為60min。檢測時間較長，質(zhì)譜的SIM模式與MRM模式相比，后者靈敏度更高；本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，多反應(yīng)監(jiān)測模式，正離子檢測對五種馬兜鈴屬藥材中的馬兜鈴酸A、B、C、D的含量進行了測定，5分鐘內(nèi)可完成檢測。與已有方法相比，本方法快速，靈敏度高，為含馬兜鈴酸藥材的質(zhì)量控制提供參考。