奧·烏力吉， 王青虎， 榮 君， 格根蘇布德， 曉 明

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028000)

山沉香為木犀科植物賀蘭山丁香Syringapinnatifolia flemslvar.alashanensisMaet S.Q.Zhou除去皮的干燥根和枝干，具有鎮(zhèn)“赫依”、清熱、止痛、平喘等功效，主治心“赫依”熱、氣喘、失眠、心跳、心絞痛等癥，主要分布于我國(guó)的內(nèi)蒙古阿拉善盟賀蘭山水源涵養(yǎng)林保護(hù)區(qū)［1-2］。山沉香現(xiàn)已載入蒙醫(yī)藥相關(guān)書(shū)籍［3-4］，但除其蒙藥學(xué)和揮發(fā)油研究之外［5-11］，本品沒(méi)有“鑒別”和“定量測(cè)定”項(xiàng)，這對(duì)山沉香的質(zhì)量、療效和安全有一定的影響。根據(jù)山沉香化學(xué)成分前期研究結(jié)果可知，山沉香主要成分有揮發(fā)油、香豆素及木脂素類化合物。為了該藥的正確使用和安全有效性，本實(shí)驗(yàn)采用TLC法對(duì)不同來(lái)源的山沉香進(jìn)行鑒別，同時(shí)運(yùn)用HPLC法同時(shí)測(cè)定其中 3，3'-二甲氧基-4，4'，9，9'-四羥基簡(jiǎn)單木脂素、3，4(3'，4')-二亞甲二氧基-9，9'-二羥基簡(jiǎn)單木脂素、Syripinnalignan A、Syripinnalignan B、Syripinnalignan C的量，為綜合評(píng)價(jià)山沉香藥材的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

KQ—100型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);AUW200D型電子天平 (日本島津);高效液相色譜儀(LC10—Atvp輸液泵，SPD—M10Avp檢測(cè)器，SCL—10Avp工作站，DGU—12A脫氣機(jī));UV—2501PC型分光光度計(jì) (日本島津)。乙腈和甲醇為色譜純 (天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);水為超純水;三氯甲烷、無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醇和磷酸等均為分析純;硅膠G(上海海洋化工廠);syripinnalignan B(S1)，syripinnalignin A(S2)，syripinnalignan C(S3)，3，3'-二甲氧基-4，4'，9，9'-四羥基簡(jiǎn)單木脂素 (S4)，3，4(3'，4')-二亞甲二氧基-9，9'-二羥基簡(jiǎn)單木脂素 (S5)均為自制［12］并用高效液相色譜儀分別測(cè)定其純度均高于99.0%，可作為對(duì)照品使用，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。藥材來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 藥材來(lái)源

2TLC鑒別

2.1 供試液制備 稱取山沉香1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，搖勻，濾過(guò)。吸取濾液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，既得。

2.2 對(duì)照品貯備液的制備 分別精密稱取S1、S2、S3、S4、S5各10 mg，置于10 mL量瓶，加甲醇溶解并用甲醇稀釋至刻度，即得。

2.3 展開(kāi)分析 分別吸取不同來(lái)源的樣品供試液和對(duì)照品溶液 (S1、S2)5 μL，點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠板上，以三氯甲烷-丙酮 (10∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，用5%的香草醛硫酸乙醇溶液顯色，加熱使斑點(diǎn)清晰。結(jié)果見(jiàn)圖2。

3 山沉香的定量測(cè)定

3.1 提取溶劑選擇 稱取樣品 (A1)4份，每份1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇 (1∶1)、甲醇和75%甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，再稱定其質(zhì)量，分別用三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇 (1∶1)、甲醇和75%甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)。分別吸取濾液10 mL，蒸干，加色譜甲醇溶解并定容至10 mL。在實(shí)驗(yàn)所用的色譜條件下，測(cè)定色譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖3和表2。

圖1 5種對(duì)照品的結(jié)構(gòu)式

圖2 不同來(lái)源山沉香和S1、S2的TLC色譜圖

圖3 不同溶劑提取液HPLC色譜圖

根據(jù)圖3和表2的結(jié)果可知，除三氯甲烷提取液的色譜峰其余提取液色譜峰的吸收峰形狀、數(shù)目和位置基本一致，但甲醇中被檢測(cè)化合物的峰面積較高，故選擇甲醇作為提取溶劑。

表2 不同溶劑提取液中被檢測(cè)化合物的峰面積

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)掃描 取山沉香樣品供試液 (A1)和對(duì)照品溶液適量，在200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果見(jiàn)圖4。根據(jù)掃描結(jié)果選定281 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖4 樣品和5種對(duì)照品的UV掃描圖

3.3 色譜條件的選擇 大連依利特hypersil ODS2色譜柱 (300 mm×4.6 mm，5 μm);檢測(cè)波長(zhǎng)281nm，流動(dòng)相為甲醇-水溶液，梯度洗脫;體積流量1.0 mL/min，記錄色譜圖時(shí)間40 min;進(jìn)樣量20 μL。在上述色譜條件下，syripinnalignan B(S1)，syripinnalignin A(S2)，syripinnalignan A(S3)，3，3'-二甲氧基-4，4'，9，9'-四羥基簡(jiǎn)單木脂素 (S4)，3，4(3'，4')-二亞甲二氧基-9，9'-二羥基簡(jiǎn)單木脂素 (S5)達(dá)到基線分離 (R＞1.5)，理論塔板數(shù)均不低于4 500。梯度洗脫程序見(jiàn)表3。

表3 梯度洗脫程序

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪畫(huà) 精密吸取S1、S2、S3、S4、S5對(duì)照品貯備液適量，分別用色譜甲醇配成不同質(zhì)量濃度的系列對(duì)照品溶液，按上述色譜條件和方法分析測(cè)定，以對(duì)照品的質(zhì)量濃度 (μg/mL)為橫坐標(biāo)，對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其回歸方程式，結(jié)果見(jiàn)表4。分離色譜圖見(jiàn)圖5。

表4 線性關(guān)系考察

圖5 山沉香供試液和對(duì)照品溶液HPLC色譜圖

3.4.2 精密度試驗(yàn) S1，S2對(duì)照品貯備液適量，用色譜甲醇稀釋至20 μg/mL對(duì)照品溶液，S3、S4、S5對(duì)照品貯備液適量稀釋成6 μg/mL對(duì)照品溶液。在上述色譜條件下，進(jìn)樣量20 μL，進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積，計(jì)算S1，S2，S3，S4，S5的RSD值分別為1.02%、1.04%、1.98%、1.42%和1.56%。

3.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試液 (A1)20 μL，注入色譜儀，在24 h內(nèi)每隔一定時(shí)間測(cè)定1次，進(jìn)行穩(wěn)定性考察。在24 h內(nèi)測(cè)定5次，數(shù)據(jù)穩(wěn)定。S1、S2、S3、S4、S5的RSD分別為1.18%、1.22%、2.01%、1.88%和1.74%。

3.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取供試品 (A1)6份，精密稱定，按上述色譜條件和定量測(cè)定項(xiàng)下進(jìn)行測(cè)定，S1，S2，S3，S4，S5的 RSD分別為 1.19%、1.34%、1.89%、2.01%和1.81%。

3.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱取供試品 (A1)6份，每份0.05 g，精密稱定，按照表5分別精密加入S1，S2，S3，S4，S5，并按定量測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果表(n=3)

3.4.6 定量測(cè)定 在上述色譜條件下，吸取不同來(lái)源山沉香供試液20 μL，注入色譜儀，按外標(biāo)二點(diǎn)法計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 樣品測(cè)定結(jié)果 (n=5)

4 討論

本實(shí)驗(yàn)選用的展開(kāi)系統(tǒng)的專屬性、分離度和重復(fù)性較好，可作為山沉香定性鑒別的依據(jù)。

以三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇 (1∶1)、甲醇和75%甲醇為溶劑進(jìn)行了提取率的比較。結(jié)果S3在三氯甲烷中提取率高外，其余被檢測(cè)成分在甲醇中提取率均高于其他溶劑，故選用甲醇為提取溶劑。

色譜條件選擇中先用幾種甲醇和水的等梯度洗脫，色譜峰分離不好，所以選用了梯度洗脫。在實(shí)驗(yàn)所用的梯度洗脫條件下，5種對(duì)照品與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5。

根據(jù)表6可知，不同來(lái)源山沉香中化合物S1和S2的相對(duì)含有量較高，但來(lái)源不同其相對(duì)含有量變化不大，其他成分也變化不大。這說(shuō)明不同來(lái)源山沉香中化學(xué)成分基本一致。

［1］阿拉嘎，圖門(mén)烏力吉，陳蘇依勒.賀蘭山丁香的資源調(diào)查報(bào)告［J］.中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2007，13(6):41.

［2］羅卜桑.蒙藥志［M］.呼和浩特:內(nèi)蒙古人民出版社，1984:1127.

［3］內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生廳.內(nèi)蒙古蒙藥材標(biāo)準(zhǔn)［M］.赤峰:內(nèi)蒙古科學(xué)技術(shù)出社，1987:360.

［4］朱亞民.內(nèi)蒙古植物藥志:第二卷［M］.呼和浩特:內(nèi)蒙古人民出版社，1989:349.

［5］龐秀生，趙明升，王 晉.蒙藥山沉香的生藥學(xué)研究［J］.中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2000(S1):59.

［6］禹玉洪，付卉青，遲蒙娜，等.蒙藥山沉香揮發(fā)油的化學(xué)組分研究［C］//大連國(guó)際色譜學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)和展覽會(huì)文集，2007.

［7］張國(guó)彬，劉利軍，李明奎，等.山沉香揮發(fā)油成分的研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，1994，29(5):271-272.

［8］Aldermasten A.Eight peak index of mass spectra(Vol 1-3)［M］.Noteingham:Mass spectrametry data certre，1983:253.

［9］Stenhagen E，Abrahamsson S，Mclafferoty F W.Registry of mass spectral data(Vol 1-2)［M］.New York:John wiley and sons Inc，1974:154.

［10］Jennings W.Qualitative analysis of flavor and frogrance volatiles by glass capillary gas chromatography［M］.New York:Academic press，1980:313.

［11］Kalsi P S，Singh D S，Chhabra B R.Cross cojugated terpenoid ketones:a new group of plant growth regulators［J］.Phytochemistry，1978，17(3):576-577.

［12］Wang Q H，Ao W L J，Bao X H，et al.Lignans fromSyringa pinnatifoliaHemsl.var.alashanensis［J］.J Asain Nat Prod Res，2012，14(4):396.