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多傘阿魏揮發(fā)油提取工藝及化學(xué)成分研究

2013-08-28 23:32雷林潔于富生王長(zhǎng)虹
中成藥 2013年6期
關(guān)鍵詞:阿魏揮發(fā)油色譜

雷林潔, 滕 亮,, 趙 欣, 于富生, 王長(zhǎng)虹

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830011;2.新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司,新疆 烏魯木齊830011;3.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所,中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201203)

阿魏為傘形科阿魏屬植物新疆阿魏Ferula sinkiangensisK.M.Shen或阜康阿魏Ferula fukanensisK.H.Shen的樹(shù)脂。主要分布于地中海、中亞及其鄰邊地區(qū)。我國(guó)約有26種1變種,主產(chǎn)于新疆。阿魏藥材是從阿魏屬植物的根或莖中得到的一種油膠樹(shù)脂。阿魏性苦、辛,溫。歸腎、胃經(jīng),具有殺滅血吸蟲[1]、鎮(zhèn)痛和戒斷的抑制作用[2]、抗?jié)儯?]、抗過(guò)敏[4]、抗菌作用[5]、抗炎作用[6]等功效。阿魏的化學(xué)成分主要是樹(shù)脂、樹(shù)膠、揮發(fā)油、多糖等,其中含揮發(fā)油約10% ~17%,樹(shù)脂約40% ~64%,樹(shù)膠約25%[7]。阿魏有香阿魏、臭阿魏之分,臭阿魏主要包含新疆阿魏、阜康阿魏與五彩阿魏。其他阿魏多為香阿魏,主要分布在烏恰、裕民、米泉、木壘、奇臺(tái)、石河子等地。上世紀(jì)70年代后,新疆阿魏和阜康阿魏被破壞的相當(dāng)嚴(yán)重,目前阜康阿魏已滅絕,全疆目前僅在拜什墩山區(qū)還有少量的野生新疆阿魏。香阿魏為傘形科植物多傘阿魏Ferula ferlaeoidis(Sted.)Korov的樹(shù)脂或根,在新疆資源分布廣泛,在維吾爾、哈薩克等民族中常代替臭阿魏入藥。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選了多傘阿魏揮發(fā)油的提取工藝,采用GC-MS對(duì)其揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行了分析,并考察提取時(shí)間對(duì)阿魏揮發(fā)油化學(xué)成分的影響,為多傘阿魏的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 氣相色譜儀 (GC-2010 Plus,日本島津);氣質(zhì)聯(lián)用儀 (Agilent 7890 A-5975C型,美國(guó));電子天平 (BS110S,北京賽多利斯天平有限公司);智能恒溫電熱套 (DRT-SX型,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

1.2 試藥 多傘阿魏 (產(chǎn)地新疆奇臺(tái)縣,20111001,由新疆華圣元醫(yī)藥科技有限公司于富生主任藥師鑒定為多傘阿魏根的樹(shù)脂);乙酸乙酯(天津市化學(xué)試劑一廠,20010408);甲醇 (天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司,20110916);丙酮 (天津永晟精細(xì)化工有限公司,20111020);無(wú)水硫酸鈉 (天津市天達(dá)凈化材料精細(xì)化工廠,050810),以上試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 多傘阿魏揮發(fā)油提取工藝的研究[18]

2.1.1 考察指標(biāo) 以阿魏油提取率為指標(biāo)對(duì)阿魏揮發(fā)油的提取工藝進(jìn)行研究。

2.1.2 多傘阿魏揮發(fā)油相對(duì)密度測(cè)定 將多傘阿魏揮發(fā)油按照2010年版《中國(guó)藥典》一部附錄XD“密度測(cè)定法”中的“比重瓶法”進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算揮發(fā)油密度,測(cè)定多傘阿魏揮發(fā)油平均密度為0.886 4 g/mL,RSD為0.001%(n=3)。

2.1.3 均勻試驗(yàn)優(yōu)選阿魏揮發(fā)油最佳提取工藝在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以阿魏揮發(fā)油提取率為考察指標(biāo),采用U7(72)均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì),考察溶劑倍數(shù)和提取時(shí)間對(duì)提取率的影響,因素水平見(jiàn)表1,試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平Tab.1 Table of levels and factors

將試驗(yàn)結(jié)果采用均勻設(shè)計(jì)回歸分析及優(yōu)化系統(tǒng)(UROS)進(jìn)行處理,得回歸方程:Y=2.187 1+1.868 6X1-0.082 6X2-0.206 7X12+0.035 7X1X2?;貧w方程顯著性檢驗(yàn)的F=96.683,復(fù)相關(guān)系數(shù)r2=0.999 9(P<0.05)。

表2 U7(72)均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Tab.2 Arrangement and the results of U7(72)uniform design

優(yōu)化條件為:X1(提取時(shí)間)=5.71 h;X2(加水量)=13.84倍,理論最大預(yù)測(cè)值為7.80%,預(yù)測(cè)區(qū)間為7.36%~8.24%。

2.1.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 分別稱取3份阿魏50 g,加入14倍水,提取5.5 h,冷卻,計(jì)算提取率。

結(jié)果平均揮發(fā)油提取率為7.77%,RSD為0.34%,說(shuō)明多傘阿魏揮發(fā)油提取工藝 (工藝Ⅰ)穩(wěn)定、合理、可行。

2.2 多傘阿魏揮發(fā)油化學(xué)成分的研究

2.2.1 多傘阿魏揮發(fā)油氣相質(zhì)譜分析

2.2.1.1 樣品制備方法 稱取多傘阿魏50 g,加入14倍蒸餾水,提取5.5 h,冷卻,收集揮發(fā)油,采用無(wú)水硫酸鈉干燥,得淡黃色揮發(fā)油,備用。分別精密量取各份樣品揮發(fā)油1 mL,置10 mL量瓶中,丙酮定容至刻度,即得。

2.2.1.2 氣相色譜質(zhì)譜分析條件[9-13]氣相色譜條件:氣質(zhì)聯(lián)用儀 (Agilent 7890 A-5975C型,美國(guó));HP-5MS毛細(xì)管色譜柱 (30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣為高純氮?dú)?載氣流量為 1 mL/min;進(jìn)樣量0.5 μL;分流比30∶1;進(jìn)樣器250℃;檢測(cè)器250℃;升溫程序?yàn)槠鹗紲囟葹?0℃,保持2 min,以2℃/min的速率程序升溫至80℃,保持5 min,最后以4℃/min升溫至180℃,保持5 min。

質(zhì)譜條件:電離方式EI;電離能量70 eV;離子源發(fā)生器溫度230℃;質(zhì)量掃描范圍30~350 amu。

2.2.1.3 氣相色譜質(zhì)譜分析結(jié)果 阿魏揮發(fā)油的氣相色譜圖見(jiàn)圖1,總離子流圖見(jiàn)圖2。采用面積歸一化法計(jì)算出各組分的相對(duì)百分含有量,經(jīng)CAS數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,確定了多傘阿魏揮發(fā)油的基本化學(xué)成分,共鑒定出44種化合物,其中主要成分為(1R)-(+)-蒎烯 (3.64%)、莰烯 (4.68%)、β-蒎烯 (2.28%)、3-蒈烯 (4.15%)、D-檸檬烯(9.08%)、異松油烯 (3.00%)、(1S,2S,4R)-醋酸-1,3,3-三 甲 基-雙 環(huán) [2.2.1]庚 烯-2-醇(3.13%)、左旋乙酸冰片酯 (17.78%)、 (E)-β-金合歡烯 (11.26%)、α-法尼烯 (7.48%)、反式-橙花叔醇 (6.33%)、愈創(chuàng)木醇 (11.44%),未檢出多硫化合物。分析鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。

圖1 多傘阿魏揮發(fā)油氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram of volatile oil from Ferula ferlaeoidis(Sted.)Korov

圖2 多傘阿魏揮發(fā)油總離子流圖Fig.2 TIC of volatile oil from Ferula ferlaeoidis(Sted.)Korov

2.3 提取時(shí)間對(duì)多傘阿魏揮發(fā)油化學(xué)組成的影響[14]

2.3.1 氣相色譜條件 氣相色譜儀 (GC-2010 Plus,日本島津);HP-5MS毛細(xì)管色譜柱 (30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣為高純氮?dú)?載氣流量為1 mL/min;進(jìn)樣量0.5 μL;分流比50∶1;總流量54.0 mL/min;壓力80.9 kPa;進(jìn)樣口溫度250℃;升溫程序?yàn)槠鹗紲囟葹?0℃,保持2 min,以4℃/min的速率程序升溫至80℃,保持5 min,以4℃/min的速率程序升溫至180℃,保持5 min,最后以4℃/min的速率程序升溫至200℃。

2.3.2 揮發(fā)油樣品制備 稱取多傘阿魏8份,每份50 g,加入14倍蒸餾水,提取時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6、7、8 h,冷卻,收集揮發(fā)油,采用無(wú)水硫酸鈉干燥,備用。

2.3.3 氣相色譜分析結(jié)果 分別進(jìn)樣2.3.2項(xiàng)樣品0.5 μL,1 h樣品氣相色譜圖見(jiàn)圖3。以提取1 h揮發(fā)油色譜為參比色譜,采用Excel2003軟件計(jì)算不同提取時(shí)間揮發(fā)油的色譜行為與提取1 h揮發(fā)油色譜行為的相似性[15],結(jié)果見(jiàn)表4。進(jìn)一步對(duì)氣相色譜中主成分色譜峰峰面積變化進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)圖4~圖6。

圖3 提取1 h揮發(fā)油樣品氣相色譜圖Fig.3 GC chromatogram of volatile oil extracted at 1 h

圖4 不同提取時(shí)間對(duì)成分1~7的峰面積的影響Fig.4 Effect of extraction time on the GC chromatogram peak area of compounds 1-7 in volatile oil

圖5 不同提取時(shí)間對(duì)成分8~9的峰面積的影響Fig.5 Effect of extraction time on the GC chromatogram peak area of compounds 8-9 in volatile oil

由圖4~6可知,多傘阿魏揮發(fā)油色譜中化學(xué)成分1~7對(duì)熱不穩(wěn)定,成分8~9為對(duì)熱較穩(wěn)定揮發(fā)性成分,而提取時(shí)間的延長(zhǎng)則有利于主成分10~12的提取。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 提取時(shí)間對(duì)多傘阿魏揮發(fā)油化學(xué)組成的影響研究表明,提取時(shí)間超過(guò)5 h揮發(fā)油化學(xué)組成種類減少,因此根據(jù)工藝Ⅰ的條件設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn),考察提取時(shí)間為4 h時(shí)不同加水量對(duì)提取率的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果得揮發(fā)油優(yōu)選提取條件 (工藝Ⅱ),試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 多傘阿魏揮發(fā)油化學(xué)成分分析結(jié)果Tab.3 Constituents and its percentage contents in volatile oil from Ferula ferlaeoidis(Sted.)Korov

表4 不同提取時(shí)間多傘阿魏油化學(xué)成分色譜相似度評(píng)價(jià)Tab.4 Evaluation of similarity of the GC chromatogram of volatile oil extracted at different time

圖6 不同提取時(shí)間對(duì)成分10~12的峰面積的影響Fig.6 Effect of extraction time on the GC chromatogram peak area ofcompounds10-12 in volatile oil

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 (n=3)Tab.5 Results of validation test(n=3)

上述結(jié)果表明優(yōu)選提取條件 (工藝Ⅱ)為加入藥材14倍水,提取4 h,揮發(fā)油平均提取率為8.02%,RSD為0.09%,說(shuō)明多傘阿魏揮發(fā)油提取工藝穩(wěn)定、合理、可行。

與工藝Ⅰ的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 (平均揮發(fā)油提取率為7.77%,RSD為0.34%)相比較,兩種提取條件所得揮發(fā)油的提取率相近。但是根據(jù)提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油化學(xué)組成影響的研結(jié)果可知提取時(shí)間超過(guò)5 h揮發(fā)油化學(xué)組成種類減少,說(shuō)明工藝Ⅱ不僅能確保揮發(fā)油的量,同時(shí)也能確保揮發(fā)油化學(xué)組成的穩(wěn)定性,因此工藝Ⅱ是更為理想的多傘阿魏揮發(fā)油提取工藝條件。

3 討論

3.1 多傘阿魏的前處理 多傘阿魏呈脂膏狀,黏稠,具持久的臭味,不易稱取。冷凍干燥、減壓干燥均不易除去其水分。為了保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性,便于物料稱量,在提取前將阿魏樹(shù)脂于-18℃冷凍24 h,藥材成塊狀,韌性下降,脆度增加,此時(shí)則極易粉碎。

3.2 GC-MS測(cè)定多傘阿魏揮發(fā)油化學(xué)成分 文獻(xiàn)調(diào)研表明新疆阿魏揮發(fā)油因含多硫化合物而具蒜臭味[10],而多傘阿魏揮發(fā)油GC-MS分析結(jié)果表明鑒定出的44種化合物中不含多硫化合物,與提取物無(wú)蒜臭氣味相一致。鑒定出的化合物成分組成及主要成分的百分含有量與文獻(xiàn)報(bào)道的香阿魏化學(xué)成分[16-19]不完全一致,這可能與產(chǎn)地、采期、測(cè)試儀器的條件有關(guān)。鑒定出的化合物中主要成分為單萜及倍半萜類衍生物,該類化合物多具有消炎抗菌及解痙鎮(zhèn)痛作用[7],這有可能是多傘阿魏在民間藥用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

3.3 多傘阿魏揮發(fā)油化學(xué)成分隨著提取時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化 本實(shí)驗(yàn)借鑒指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)的方法,以提取1 h的揮發(fā)油色譜圖作為參比色譜,利用簡(jiǎn)便易行的Excel 2003軟件進(jìn)行樣品氣相色譜峰的相似度計(jì)算,結(jié)果表明揮發(fā)油提取時(shí)間不宜超過(guò)5 h。當(dāng)揮發(fā)油提取時(shí)間超過(guò)5 h,無(wú)論是相關(guān)系數(shù)還是余弦?jiàn)A角均出現(xiàn)較為明顯的下降。進(jìn)一步分析提取時(shí)間對(duì)氣相色譜主成分色譜峰峰面積的影響,結(jié)果提示12個(gè)主成分中成分1~7為對(duì)熱不穩(wěn)定揮發(fā)性成分,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)含有量有下降的趨勢(shì),成分8~9為對(duì)熱較穩(wěn)定揮發(fā)性成分,提取時(shí)間的變化對(duì)含有量影響不是很明顯,而提取時(shí)間的延長(zhǎng)則有利于成分10~12的提取,可能是因?yàn)檫@類成分對(duì)熱穩(wěn)定、分子量大、沸點(diǎn)高、氣化蒸發(fā)所需能量較大的緣故。以上分析提示在揮發(fā)油提取工藝研究中除了關(guān)注揮發(fā)油的提取量外,還需關(guān)注揮發(fā)油質(zhì)的變化,即提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)性成分化學(xué)穩(wěn)定性的影響。

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