雷 紅，董 梅，劉 敏，孫敏霞，孟祥紅，佟愛(ài)華，劉 昕

解放軍第309醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100091

碳青霉烯酶是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥的重要機(jī)制之一。鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶主要包括兩大類(lèi)酶，即D類(lèi)苯唑西林(oxacillin，OXA)酶和B類(lèi)金屬β-內(nèi)酰胺酶[1-2]。其中OXA型碳青霉烯酶是引起世界范圍內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥的最重要原因[3]。OXA型碳青霉烯酶是能水解苯唑西林的β-內(nèi)酰胺酶，屬于Ambler分子分類(lèi)中的D類(lèi)酶，該類(lèi)酶可以水解青霉素類(lèi)、頭孢菌素、碳青霉烯類(lèi)和氨曲南等抗菌藥物，導(dǎo)致產(chǎn)酶細(xì)菌對(duì)這些抗菌藥物耐藥[4]。本文研究耐亞胺培南鮑曼不動(dòng)桿菌的碳青霉烯酶基因型，對(duì)臨床合理應(yīng)用抗菌藥物和醫(yī)院感染監(jiān)控提供科學(xué)依據(jù)。

材料和方法

1 菌株來(lái)源 收集解放軍第309醫(yī)院2010年4-12月住院患者的非重復(fù)耐亞胺培南鮑曼不動(dòng)桿菌68株，分離菌株均使用甘油肉湯菌種保留管-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 主要儀器和試劑 PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad)，電泳儀(北京六一儀器廠)，LB肉湯，瓊脂糖(Biowest，西班牙)，ExTaq DNA聚合酶等。

3 多重PCR引物 所用PCR引物均由生物工程(上海)有限公司合成，各引物序列見(jiàn)表1。多重PCR擴(kuò)增體系及程序見(jiàn)表2。

多重PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性 25 s，52℃退火 40 s，72℃延伸 50 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃再延伸6 min。同時(shí)以無(wú)菌水為陰性對(duì)照。

4 DNA模板制備 挑取單個(gè)菌落轉(zhuǎn)接至LB肉湯中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)8 h。取2.0 ml菌液，采用加熱煮沸方法制備DNA模板。制備好的模板置于-20℃凍存。

5 PCR產(chǎn)物測(cè)序及序列比對(duì) 將OXA-23和唯一1株OXA-58陽(yáng)性菌株，采用PCR檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物由北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，并采用DNASTAR軟件把測(cè)序結(jié)果與Genbank進(jìn)行比對(duì)。

表1 多重PCR引物序列及預(yù)計(jì)PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度Tab.1 Primers used in PCR and length of PCR product fragments

表2 50μl多重PCR反應(yīng)體系Tab.2 PCR amplification in 50μl

結(jié) 果

1 多重PCR擴(kuò)增OXA基因 共擴(kuò)增68株臨床分離的耐亞胺培南鮑曼不動(dòng)桿菌，7株菌只攜帶OXA-51基因(檢出率為10.29%)，60株菌同時(shí)攜帶OXA-51和OXA-23基因(檢出率為88.24%)，僅有1株菌株同時(shí)攜帶OXA-51和OXA-58基因(檢出率為1.47%)，未擴(kuò)增到OXA-24基因，見(jiàn)圖1。

2 OXA-23基因測(cè)序和比對(duì) 對(duì)PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，在Genbank經(jīng)Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因片段與序列號(hào)JQ002680.1基因片段的blaOXA-23基因序列的同源性均達(dá)99%，表明菌株中blaOXA-23基因是高度保守。

3 OXA-58基因測(cè)序和比對(duì) 對(duì)PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，在Genbank經(jīng)Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因片段與序列號(hào)HQ219687.1基因片段的blaOXA-58基因序列同源性達(dá)99%。

圖1 多重PCR檢測(cè)68株鮑曼不動(dòng)桿菌OXA基因電泳圖第3和第16號(hào)株僅具有OXA-51基因，其余14株均同時(shí)具有OXA-51和OXA-23基因Fig.1 PCR showing electrophoresis for OXA genes in 68 imipenemresistant Acinetobacter baumannii strains OXA-51 gene in No.3 and 16 strains and OXA-51 and OXA-23 genes in No.14 strain

討 論

鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制是該菌產(chǎn)D類(lèi)碳青霉烯酶[5-6]。D類(lèi)碳青霉烯酶(OXA型)屬絲氨酸蛋白酶，通常水解苯唑西林、甲氧西林等。1993年P(guān)aton等報(bào)道世界上第1例鮑曼不動(dòng)桿菌產(chǎn)碳青霉烯酶活性的β-內(nèi)酰胺酶，并命名為ARI-1，該菌可水解亞胺培南，水解活性不被克拉維酸和EDTA所抑制。該菌株來(lái)源于1985年蘇格蘭愛(ài)丁堡皇家醫(yī)院1例病人的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌分離物。直到2000年，Donald等[7]對(duì)ARI-1酶的氨基酸序列進(jìn)行分析，將ARI-1重新命名為OXA-23。從此，在世界范圍內(nèi)相繼報(bào)道耐碳青霉烯類(lèi)鮑曼不動(dòng)桿菌攜帶有OXA基因。根據(jù)氨基酸序列的同源性分類(lèi)，D類(lèi)酶分為9個(gè)亞組[8-9]，第1亞組包括OXA-23、OXA-27和 OXA-49； 第 2亞 組 OXA-24、OXA-25、OXA-26、OXA-40和OXA-72；第3亞 群 由OXA-51、OXA-64——OXA-71、OXA-75——OXA-78、OXA-83、OXA-84、OXA-86——OXA-89、OXA-91、OXA-92、OXA-94 和OXA-95組成，第4亞組僅具有OXA-58；第5亞組為染色體編碼酶OXA-55和OXA-SHE組成；第6亞組由OXA-48、OXA-54；第7亞組由OXA-50家族組成，包括OXA-50a——OXA-50d；第8亞組包括 OXA-60家 族 (OXA-60a——OXA-60d)；第 9亞 組為OXA-62。然而經(jīng)臨床研究發(fā)現(xiàn)9亞組D類(lèi)酶中，臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌主要包括前4個(gè)亞組，其 代 表 酶 分 別 為 OXA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-58型。

本文通過(guò)研究前4個(gè)亞組OXA基因發(fā)現(xiàn)，在68株分離于臨床患者的耐亞胺培南鮑曼不動(dòng)桿菌中，全部攜帶OXA-51基因(檢出率為100.0%)，只攜帶OXA-51基因有7株(檢出率約為10.29%)；同時(shí)攜帶OXA-51和OXA-23基因有60株(檢出率約為88.24%)；只有1菌株同時(shí)攜帶OXA-51和OXA-58基因(檢出率約為1.47%)；未擴(kuò)增到OXA-24基因。本研究結(jié)果表明解放軍第309醫(yī)院耐亞胺培南鮑曼不動(dòng)桿菌攜帶OXA基因以O(shè)XA-51+OXA-23基因?yàn)橹鳌４私Y(jié)果不僅與Woodford等[10]報(bào)道相一致，也與國(guó)內(nèi)大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道相一致[2,11-13]，其中王輝報(bào)道1999-2002年北京、廣州兩地對(duì)亞胺培南耐藥的不動(dòng)桿菌研究，絕大多數(shù)菌株產(chǎn)OXA-23型碳青霉烯酶；沈定霞報(bào)道絕大多數(shù)鮑曼不動(dòng)桿菌含有OXA-23型碳青霉烯酶。由此說(shuō)明中國(guó)大多數(shù)地區(qū)耐亞胺培南鮑曼不動(dòng)桿菌以產(chǎn)OXA-51+OXA-23型碳青霉烯酶菌株為主要的流行株。OXA-58首次發(fā)現(xiàn)于2003年法國(guó)圖盧茲分離的碳青霉烯類(lèi)耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，該酶可水解青霉素、苯唑西林和亞胺培南，但不水解超廣譜β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物。OXA-24基因位于染色體上，只能發(fā)生垂直傳播，即親代傳遞給子代，可以水解亞胺培南、美羅培南等碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物，但對(duì)苯唑西林的水解能力較弱或者不水解。本次研究未檢測(cè)到OXA-24基因，與國(guó)內(nèi)報(bào)道相一致[2,11]。因?yàn)閷?duì)亞胺培南耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌具有不同的OXA耐藥基因型，那么攜帶不同的OXA耐藥基因型的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)亞胺培南耐藥水平是否不同，有待進(jìn)一步研究。

1 Bebrone C. Metallo-beta-lactamases （classification， activity， genetic organization， structure， zinc coordination） and their superfamily［J］.Biochem Pharmacol， 2007， 74（12）：1686-1701.

2 王輝，孫宏莉，廖康，等.北京和廣州地區(qū)四家醫(yī)院不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶基因型研究［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2005，28（6）：636-641.

3 湯鳳珍，張偉紅，陳惠玲．碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶基因型研究［J］.中國(guó)感染與化療雜志，2010，10（5）：354-356．

4 王輝，陳民鈞．碳青霉烯酶：未來(lái)困擾我們的難題［J］.中華內(nèi)科雜志，2003，42（5）：354-356．

5 Poirel L， Nordmann P. Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii： mechanisms and epidemiology［J］. Clin Microbiol Infect， 2006， 12（9）：826-836.

6 Naas T， Levy M， Hirschauer C， et al. Outbreak of carbapenemresistant Acinetobacter baumannii producing the carbapenemase OXA-23 in a tertiary care hospital of Papeete， French Polynesia［J］.J Clin Microbiol， 2005， 43（9）： 4826-4829.

7 Donald HM， Scaife W， Amyes SG， et al. Sequence analysis of ARI-1， a novel OXA beta-lactamase， responsible for imipenem resistance in Acinetobacter baumannii 6B92［J］. Antimicrob Agents Chemother， 2000， 44（1）：196-199.

8 Walther-Rasmussen J， H?iby N. OXA-type carbapenemases［J］. J Antimicrob Chemother， 2006， 57（3）： 373-383.

9 Brown S， Amyes S. OXA （beta）-lactamases in Acinetobacter： the story so far［J］. J Antimicrob Chemother， 2006， 57（1）：1-3.

10 Woodford N， Ellington MJ， Coelho JM， et al. Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp［J］. Int J Antimicrob Agents， 2006， 27（4）： 351-353.

11 張偉紅，葉惠芬，楊銀梅，等．耐亞胺培南鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥表型和碳青霉烯酶基因型分析［J］.中國(guó)感染與化療雜志，2011，11（1）：45-48．

12 楊培洪，凌保東．耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌OXA酶基因研究［J］.中國(guó)抗生素雜志，2011，36（9）：703-707．

13 沈定霞，閆中強(qiáng)，羅燕萍，等．檢測(cè)多藥耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌的碳青酶烯酶及整合酶基因［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2008，18（1）：11-13．