王國賢，李瑞芳，商淑慧，李 飛，李兆剛，劉珊珊

1遼寧醫(yī)學院 藥理教研室，遼寧錦州 121001；2河北省邯鄲市中醫(yī)院，河北邯鄲 056000

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病引發(fā)的一種慢性病癥，它以心肌病理改變?yōu)樘卣?。DCM的發(fā)病機制非常復雜，涉及到心肌肥大，細胞凋亡增加，自主神經(jīng)功能紊亂等多種機制，其中，心肌功能改變、凋亡增多是DCM重要的病理改變之一，但其機制尚未明了。符麗娟[1]等學者發(fā)現(xiàn)，在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過程中，確實存在心肌細胞凋亡的現(xiàn)象。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是一種新的細胞凋亡途徑，它不同于死亡受體途徑和線粒體途徑[2]。適量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可保護細胞，持續(xù)或長時間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激則會加速細胞凋亡。當發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，它的經(jīng)典標志物GRP78蛋白大量表達，并激活3條凋亡通路，相應凋亡機制包括：CHOP(C/EBP homologous protein)轉(zhuǎn)錄激活；JNK(c-Jun N-terminal Kinases)信號途徑活化；Caspase-12的活化等。而Caspase-12通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特有依賴性的細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導通路。

α-硫辛酸是公認的萬能抗氧化劑，對糖尿病大鼠的心肌細胞有一定的保護作用[3]。本實驗通過建立糖尿病心肌病大鼠模型，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)的角度研究α-硫辛酸對糖尿病心肌病大鼠ERS經(jīng)典標志物GRP78及特有的凋亡途徑Caspase-12表達的影響，以探討α-硫辛酸是否能通過阻斷ERS引發(fā)的Caspase-12特有細胞凋亡途徑對心肌細胞產(chǎn)生的保護作用。

材料和方法

1 材料 α-硫辛酸(美國Sigma公司)，鏈脲佐菌素 (Streptozocin，STZ)(美 國 Sigma公 司 )。SureStep Plus血糖檢測儀(美國強生公司)。TUNEL染色試劑盒(南京凱基生物公司)。GRP78一抗、二抗(北京博奧森試劑公司)，Caspase-12單克隆抗體(abcam生物制品有限公司)，血流動力學測定儀器(浙江大學儀器廠制造，H231025)。

2 糖尿病模型建立與分組 健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量200~250 g(由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供)，飼養(yǎng)1周后，其中隨機選取35只，采用鏈脲佐菌素以60 mg/kg于左下腹腔一次性注射建立大鼠糖尿病模型。另15只注射枸櫞酸緩沖液當做正常對照組。72 h后尾靜脈取血，測血糖，以血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。造模中：3只死亡，2只造模失敗。30只糖尿病大鼠隨機分為2組，糖尿病組和α-硫辛酸組，每組各15只。造模成功后飼養(yǎng)1周，α-硫辛酸治療組每日9：00給予灌胃60 mg/(kg·d)連續(xù)12周，糖尿病組及正常組給予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃。

3 血糖和血流動力學測定 各組大鼠于實驗結束前采用SureStep Plus血糖儀檢測空腹血糖。然后給予腹腔麻醉，分離頸總動脈，并將微型心導管經(jīng)頸總動脈送至左心室，測定左室收縮末壓(LVSP)和舒張末壓(LVEDP)、左室壓力最大上升和下降速率 (±dp/dt max)。

4 TUNEL測定細胞凋亡 切片常規(guī)脫蠟水化后，加入蛋白酶K工作液，37℃反應30 min，PBS浸泡5 min，清洗3次。切片滴加2滴封閉液，室溫(15~25℃)封閉10 min后再用PBS清洗。樣本滴加100μl TdT酶反應液，避光濕潤37℃反應1 h后PBS清洗。滴加100μl Streptavadin-HRP，避光濕潤37℃反應30 min，PBS清洗。每張片子加2滴現(xiàn)配制的DAB溶液。鏡下觀察染色深淺，染好后用蒸餾水終止顯色反應。將切片放入蘇木素染液，染色10 min，用蒸餾水沖洗干凈。最后進行封片，并在顯微鏡下觀察。隨機選取5個高倍視野，計算出平均每100個細胞中的凋亡細胞數(shù)，以百分數(shù)(%)表示凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

5 GRP78和Caspase-12蛋白測定 采用Western Blot法，取-80℃凍存心肌標本100 mg加入裂解液中剪碎后移入1.5 ml EP管中，4℃12 000 r/min離心25 min，取上清液進行蛋白定量。SDS-PAGE電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V，半干法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，恒壓電泳95 V，室溫1 h，4℃卵育過夜，按0.1 ml/cm2膜面積加入1∶500一抗，雜交2h，封閉液漂洗后按0.1 ml/cm2膜面積加入1∶500二抗，搖床雜交2 h，漂洗后加顯色劑，避光顯色2~5 min，條帶出現(xiàn)，終止反應。以β-actin作為內(nèi)參，進行比較。

6 免疫組織化學法檢測Caspase-12蛋白表達 石蠟防脫切片后60℃烤片90 min；常規(guī)脫蠟至水洗；高壓熱修復抗原；滴加正常羊血清封閉液；滴加1∶100稀釋一抗；滴加生物素化二抗；滴加試劑SABC；DAB顯色；蘇木素輕度復染；脫水，透明，封片。

7 統(tǒng)計學分析 所統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)用-x±s表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，進行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 α-硫辛酸對大鼠血糖、心功能影響 與正常組比較，α-硫辛酸組血糖升高，心功能出現(xiàn)異常；糖尿病模型組大鼠血糖升高、心功能LVSP降低、LVEDP升高、+dp/dtmax和-dp/dtmax降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與糖尿病模型組比較，α-硫辛酸組血糖降低但仍高于正常組，LVSP升高、LVEDP降低、+dp/dtmax、-dp/dtmax體現(xiàn)出不同程度升高、差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明α-硫辛酸能改善糖尿病大鼠的血糖和心功能。見表1。

2 GRP78和Caspase-12蛋白含量測定 與對照組比較，糖尿病模型組大鼠中GRP78和Caspase-12蛋白表達值明顯增高(P＜0.05)，α-硫辛酸干預組中GRP78和Caspase-12表達值低于糖尿病模型組(P＜0.05)。見圖1、表2。

3 TUNEL測定細胞凋亡 正常組心肌內(nèi)偶可見細胞凋亡，糖尿病組凋亡細胞數(shù)明顯增多，α-硫辛酸組AI(7.19±0.29)%明顯少于糖尿病組AI(11.28±0.33)%(P＜0.05)，但高于正常組 AI(1.05±0.25)%(P＜0.05)。凋亡細胞為棕色，正常細胞為藍紫色(×400)。見圖2。

4 免疫組織化學檢測 正常組大鼠心肌中GRP78和Caspase-12的蛋白表達較弱，表現(xiàn)出輕度或點狀染棕黃色；糖尿病組大鼠心肌GRP78和Caspase-12蛋白表達呈強陽性，著色范圍大，呈棕褐色；α-硫辛酸組GRP78和Caspase-12蛋白表達呈陽性，中等范圍著棕色。與正常組比較，糖尿病組灰度值均顯著降低(P＜0.05)；與糖尿病組比較，α-硫辛酸組灰度值有所提升，但仍低于對照組，(灰度值越低，蛋白表達量越高)。見圖3、表3。

表1 各組大鼠血糖、心功能比較Tab.1 Blood glucose level and cardiac function in different groups(-x±s, n=15)

表2 各組大鼠心肌組織GRP78和Caspase-12與β-actin比值Tab.2 Ratio of GRP78 and caspase-12 vs β-actin on myocardial tissue of different groups

表3 各組大鼠心肌組織GRP78和Caspase-12蛋白質(zhì)表達水平比較Tab.3 Expression level of GRP78 and caspase-12 in myocardial tissue of different groups

圖1 Western blot檢測大鼠GRP78和Caspase-12蛋白水平A：正常組；B：糖尿病模型組；C：α-硫辛酸組Fig.1 Western blot showing expression level of GRP78 and caspase-12 in rats A: Control group; B: Diabetic group; C: A - LA group

討 論

近來研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡，是一種不同于死亡受體途徑和線粒體途徑的新的凋亡途徑[4-5]。ERS通過兩種途徑對細胞產(chǎn)生影響。其一，保護細胞，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，促使細胞生存。其二，誘導細胞凋亡，在強刺激或持續(xù)過久的ERS時，GRP78大量表達并激活多條途徑誘導細胞凋亡，Caspase-12凋亡途徑為其經(jīng)典途徑。

GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，是檢測ERS的標志蛋白[6]，在正常狀態(tài)下，GRP78沒有或者表達極少。但當ERS狀態(tài)下，GRP78大量表達。GRP78對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境極度敏感，很多能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激變化的因素都能直接或間接引起GRP78表達的改變，如高血糖、高血壓、氧化應激、炎癥等因素都可引發(fā)其蛋白大量釋放。本實驗結果顯示，糖尿病模型組GRP78大量表達，α-硫辛酸實驗組GRP78表達高于正常組，但明顯低于糖尿病組，提示用α-硫辛酸治療減弱了糖尿病大鼠心肌組織局部ERS狀態(tài)。

正常狀態(tài)下Caspase-12無活性并滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面。當ERS持續(xù)加強后，Caspase-12解離，游離的Caspase-12直接激活Caspase-9，后者通過活化Caspase-3等一系列反應，最終導致細胞凋亡。因此游離的Caspase-12是可導致細胞凋亡的關鍵蛋白[7]。Caspase-12定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面，是介導ERS凋亡的關鍵蛋白酶，在膜受體或線粒體凋亡途徑中不被活化，且已被證實[8-9]。本實驗結果顯示，Caspase-12在糖尿病組表達最高，細胞凋亡增多；α-硫辛酸組蛋白顯著減少(P＜0.05)，同時細胞凋亡率明顯降低(P＜0.05)，提示α-硫辛酸治療組通過降低Caspase-12蛋白的含量，抑制細胞凋亡途徑進而降低了糖尿病大鼠心肌細胞凋亡率。

本實驗結果顯示，正常組大鼠血糖，心功能都未出現(xiàn)異常，心肌組織中GRP78和Caspase-12僅有極少量表達，而糖尿病組大鼠血糖升高，心功能受損(LVSP降低、LVEDP升高、+dp/dtmax、-dp/dtmax降低)，心肌細胞凋亡數(shù)增多并伴有GRP78、Caspase-12蛋白大量表達，α-硫辛酸對糖尿病心肌病有一定的保護作用，降低血糖，改善心功能，并在一定程度通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的發(fā)生，減少Caspase-12和GRP78表達，進一步抑制了糖尿病心肌細胞凋亡的發(fā)生。

圖2 TUNEL檢測心肌細胞凋亡指數(shù) A：正常組；B：糖尿病模型組；C：α-硫辛酸組Fig.2 TUNEL showing cell apoptotic index A: Control group; B: Diabetic model group; C: A - LA group

圖3 免疫組織化學檢測心肌Caspase-12蛋白水平 A：正常組；B：糖尿病模型組；C：α-硫辛酸組Fig.3 Immunohistochemistry showing caspase-12 protein expression level in myocardial tissue(×400)A: Control group; B: Diabetic model group; C: A-LA group

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