郭恩凱，李 冰，申 晶，程 愈，郝好杰，韓慶旺，伍志強，韓為東，母義明

解放軍總醫(yī)院，北京 100853 1內(nèi)分泌科；2基礎(chǔ)醫(yī)學所

Oct4基因是POU轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，主要表達于胚胎干細胞、生殖干細胞以及未分化胚胎癌中，也被稱為Oct3、POU5F1，是誘導多能干細胞四個因子中的關(guān)鍵基因，被認為啟動成體細胞重編程的“看門人”。在胚胎發(fā)育過程中，肝臟和胰腺具有同源性[1]，和胰島β細胞有相似的血糖反應性[2]，以肝細胞作為重編程為胰島β細胞的體細胞來源，具有潛在的應用前景。本實驗通過構(gòu)建含有Oct4的慢病毒表達載體，包裝并濃縮病毒后感染小鼠原代肝細胞；Oct4介導肝細胞去分化，出現(xiàn)內(nèi)胚層早期標記物(definitive endoderm marker)Sox17表達，為下一步向β細胞誘導分化奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶MluI和SalI、PrimeSTAR HS聚合酶、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司；普通PCR產(chǎn)物純化試劑盒和小量質(zhì)粒抽提試劑盒、DL2000、Taq DNA聚合酶、TOP10感受態(tài)購自天根生化科技有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、Trizol、Knockout血清購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；肝細胞培養(yǎng)液購自ScienCell公司；William's Medium E、膠原酶Ⅳ購自Sigma公司；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自PAA公司；PEI購自Polysciences公司；PEG6000購自Merck公司；慢病毒載體pWPTGFP及質(zhì)粒psPAX2 和pMD2G、小鼠胚胎干細胞cDNA、HEK293T細胞本實驗室保存。

2 實驗動物 C57BL/6小鼠，購于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，8~10周齡。

3 主要儀器設備 PCR儀(ABI公司)；離心機(Eppendorf公司)；電泳儀購(北京市六一儀器廠)；凝膠成像系統(tǒng)1D(KodaK公司)；臺式恒溫振蕩器(江蘇太倉市實驗設備廠)；恒溫培養(yǎng)箱(上海市躍進醫(yī)療器械一廠)；超凈工作臺(北京四達凈化有限公司)；細胞培養(yǎng)箱(賀利氏公司)；相差顯微鏡(Nikon公司)；熒光顯微鏡購自Zeiss公司。

4 小鼠肝細胞的分離和體外培養(yǎng) 小鼠原代肝細胞分離采用兩步膠原酶灌流法[3]，略加修改。用1%戊巴比妥麻醉小鼠，腹腔注射肝素抗凝后，固定并暴露肝臟，沿肝門靜脈起始插入24G靜脈留置針，連接20 ml注射器(裝有37℃預熱灌流液Ⅰ)，同時剪斷下腔靜脈，按5ml/min緩慢推注，至流出液顏色與灌注液相同，換成灌流液Ⅱ(含有0.02%膠原酶Ⅳ)繼續(xù)灌流，灌流完畢后仔細剪取肝臟并移至無菌培養(yǎng)皿中，灌流液Ⅱ清洗肝臟，制成肝細胞懸液，并經(jīng)100μm尼龍濾網(wǎng)(BD公司)，1 000 r/min離心5 min。用黏附培養(yǎng)基(包含Williams E medium，1%非必需氨基酸，10%胎牛血清)重懸肝細胞，臺盼藍染色，活細胞＞90%，按6×105/孔接種在六孔板中，6~8 h后去除黏附培養(yǎng)基，換成肝細胞培養(yǎng)基。

5 Oct4慢病毒載體構(gòu)建 根據(jù)NCBI發(fā)表的小鼠Oct4序列設計分別含有MluI和SalI酶切位點上、下游引物，上游引物在ATG起始密碼子上游添加Kozak序列GCCACC，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，引物序列如下：Forward：5'GAT CACGCGTGCCACCATGGCTGGACACCTGGCTTC3'；Reverse：5'GATCGTCGACTCAGTTTGAATGCATGG GAGAGC3'。以小鼠ES細胞cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應程序為：98℃ 10 s，68℃ 2 min；循環(huán)擴增35次。擴增結(jié)束后產(chǎn)物進行電泳檢測，膠回收后經(jīng)MluI和SalI雙酶切過夜，酶切后經(jīng)PCR純化試劑盒純化去除內(nèi)切酶。載體pWPT-GFP經(jīng)MluI和SalI雙酶切并回收載體片段，和Oct4酶切后的片段經(jīng)T4 DNA連接酶16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，涂氨芐抗性平板，37℃培養(yǎng)15 h，挑取單克隆擴增培養(yǎng)，抽取質(zhì)粒進行酶切、測序鑒定，質(zhì)粒命名為pWPT-Oct4。

6 病毒包裝、濃縮及感染小鼠原代肝細胞 將pWPT-Oct4∶包裝質(zhì)粒(psPAX2)∶外殼質(zhì)粒(pMD 2G)=4∶2∶1的比例轉(zhuǎn)染293T細胞，收集48 h、72 h病毒上清液，0.45μm濾器過濾后，按2∶1的體積比添加3×病毒濃縮液(25.5% PEG6000，1.2mol/L NaCl)濃縮病毒上清液。pWPT-GFP質(zhì)粒包裝濃縮過程同pWPT-Oct4。梯度稀釋后感染293T細胞，檢測病毒滴度。按感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)30感染已培養(yǎng)48 h的肝細胞，培養(yǎng)液中加入polybrene 8μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，吸去培養(yǎng)基，換成重編程培養(yǎng)基(包含DMEM/F12培養(yǎng)基，10%Knockout DMEM，1 mmol谷氨酰胺，1%非必需氨基酸，1%青霉素/鏈霉素，0.11 mmol β-巰基乙醇)。

7 RT-PCR法檢測目的轉(zhuǎn)錄因子的表達 選取下列細胞分組：新鮮分離肝細胞(hepatocyte 0 d)，二次感染Oct4慢病毒后3 d、7 d、12 d、18 d細胞(Oct4-3 d、Oct4-7 d、Oct4-12 d、Oct4-18 d)， 感染GFP慢病毒18 d(GFP-18 d)和未感染同期培養(yǎng)18d的肝細胞(hepatocyte 18 d)。Trizol試劑提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并以其為模板進行PCR擴增。PCR引物參考NCBI上的mRNA序列利用Primer5軟件設計(表1)。PCR擴增條件：94℃預變性4 min，94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸40 s，30個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下檢測，凝膠成像系統(tǒng)分析。

表1 RT-PCR引物信息Tab.1 Sequences of primers for RT-PCR

結(jié) 果

1 pWPT-Oct4表達載體鑒定 pWPT-Oct4質(zhì)粒用MluI和SalI雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳可見特異性Oct4(1059bp)擴增片段，與理論值相符(圖1)。pWPT-Oct4表達載體經(jīng)測序，構(gòu)建的慢病毒載體基因序列與預期符合，證明成功構(gòu)建表達載體。

2 Oct4在慢病毒感染細胞中表達 為了檢測慢病毒的感染效率，采用含有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的慢病毒感染肝細胞進行評測。GFP慢病毒感染肝細胞72 h后，在倒置的熒光顯微鏡上觀察，可見綠色熒光，原代肝細胞感染效率＞50%(圖2)。在Oct4慢病毒感染后7 d、12 d、18 d的細胞中檢測到Oct4的表達(圖3)。

3 Oct4介導小鼠原代肝細胞去分化 為了檢驗Oct4介導小鼠原代肝細胞能否發(fā)生去分化，通過RTPCR檢測了肝細胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達。Oct4慢病毒感染肝細胞后，白蛋白(Albumin，Alb)和轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(transthyretin，Ttr)的表達逐漸下降；甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，Afp)在新分離的肝細胞沒有表達，在感染后3d檢測到表達，進一步提示肝細胞去分化。

4 去分化細胞出現(xiàn)內(nèi)胚層早期標記物的表達 為了進一步檢測Oct4介導的肝細胞去分化后發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄因子。Sox17在感染Oct4后第12 d、18 d檢測到表達。而GFP-18 d和hepatocyte18d均未檢測到Sox17的表達。感染Oct4后18 d后沒有檢測到Oct4、Sox2和Nanog的內(nèi)源性表達，GFP18d組和hepatocyte18d組中也未出現(xiàn)Oct4、Sox2和Nanog表達。

圖1 肝細胞相應轉(zhuǎn)錄因子的表達Fig.1 Expression of corresponding hepatocyte transcription factors

圖2 慢病毒感染原代肝細胞效率Fig.2 Efficiency of lentivirus- infected primary liver cells(72 h after second infection)

圖3 外源性Oct4在細胞中表達Fig.3 Expression of exogenous Oct4 in liver cells

圖4 肝細胞轉(zhuǎn)錄因子的表達Fig.4 Expression of liver cell transcription factors

圖5 檢測Sox17和多能性因子的表達Fig.5 Expression of Sox17 and pluripotency factors in liver cells

討 論

Oct4是迄今人們發(fā)現(xiàn)最早也是最重要的維持胚胎干細胞多潛能性和自我更新的關(guān)鍵基因。在鼠的體內(nèi)試驗中發(fā)現(xiàn)下調(diào)Oct4能使鼠神經(jīng)干細胞分化[4]，異位表達Oct4基因可以阻止鼠上皮祖細胞的分化，并且引起上皮細胞的異常增生[5]。本試驗中Oct4慢病毒感染小鼠原代肝細胞，成熟的標記物Alb、Ttr表達逐漸降低，不成熟的標記物出現(xiàn)增強，在進一步的培養(yǎng)過程中，成熟的標記物和不成熟的標記物都逐漸減弱。肝細胞在體外培養(yǎng)的過程中會經(jīng)歷成熟肝細胞標記物的表達逐漸減弱，不成熟肝細胞標記物逐漸加強的去分化過程[6]，但在感染Oct4慢病毒12 d后出現(xiàn)明確內(nèi)胚層的標記物Sox17表達，而GFP-18d和hepatocyte18d組均未檢測到Sox17的表達。

雖然Oct4介導小鼠成熟的肝細胞去分化，出現(xiàn)Sox17的表達，但是沒有Oct4、Nanog及Sox2等多能性基因的內(nèi)源性表達，所以Oct4介導小鼠原代肝細胞去分化沒有到達多能狀態(tài)。本實驗研究的關(guān)鍵點是通過單獨Oct4介導小鼠成熟的肝細胞去分化，實現(xiàn)內(nèi)胚層早期標記物Sox17的表達。內(nèi)胚層的形成是胰腺分化的一個先決條件，而Sox17作為轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族中的一員，在內(nèi)胚層的形成過程中發(fā)揮重要作用[7-8]，在體外將胚胎干細胞分化為產(chǎn)生胰島素細胞的研究中，其也是分化過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[9]。

Oct4介導體細胞重編程的進一步研究，使人們對Oct4的功能有了更深入的了解。2010年，研究者利用單獨Oct4介導成纖維細胞重編程，直接誘導為造血祖細胞，后者并聯(lián)合小分子化合物分化為造血譜系終末細胞，為體細胞重編程提供了新路徑[10]。本實驗同樣利用單獨Oct4介導體細胞重編程，去除癌基因的整合，增加了重編程為目的細胞的安全性[11]，并選擇與胰島β細胞具有相同發(fā)育起源的肝細胞作為體細胞的來源，表達內(nèi)胚層早期標記物Sox17，為改變細胞譜系提供了前提，下一步實驗將聯(lián)合小分子化合物誘導分化功能性胰島素產(chǎn)生細胞。

1 Deutsch G， Jung J， Zheng M， et al. A bipotential precursor population for pancreas and liver within the embryonic endoderm［J］.Development， 2001， 128（6）： 871-881.

2 Yang LJ. Liver stem cell-derived beta-cell surrogates for treatment of type 1 diabetes［J］. Autoimmun Rev， 2006， 5（6）：409-413.

3 Li WC， Ralphs KL， Tosh D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes［J］. Methods Mol Biol， 2010， 633 ：185-196.

4 Okuda T， Tagawa K， Qi ML， et al. Oct-3/4 repression accelerates differentiation of neural progenitor cells in vitro and in vivo［J］.Brain Res Mol Brain Res， 2004， 132（1）： 18-30.

5 Hochedlinger K， Yamada Y， Beard C， et al. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues［J］. Cell， 2005， 121（3）： 465-477.

6 Meivar-Levy I， Sapir T， Gefen-Halevi S， et al. Pancreatic and duodenal homeobox gene 1 induces hepatic dedifferentiation by suppressing the expression of CCAAT/enhancer-binding protein beta［J］. Hepatology， 2007， 46（3）： 898-905.

7 Shivdasani RA. Molecular regulation of vertebrate early endoderm development［J］. Dev Biol， 2002， 249（2）： 191-203.

8 Jang YY， Sharkis SJ. Fetal to adult stem cell transition： knocking Sox17 off［J］. Cell， 2007， 130（3）： 403-404.

9 D'amour KA， Bang AG， Eliazer S， et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells［J］. Nat Biotechnol， 2006， 24（11）： 1392-1401.

10 Szabo E， Rampalli S， Risue?o RM， et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors［J］. Nature， 2010， 468（7323）： 521-526.

11 Huangfu D， Osafune K， Maehr R， et al. Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2［J］.Nat Biotechnol， 2008， 26（11）：1269-1275.