蘇龍翔，劉進(jìn)文，方向群，李天志，王俊峰，郭英華，常 德，徐國(guó)綱，劉長(zhǎng)庭

1解放軍總醫(yī)院 南樓呼吸科，北京 100853；2南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 370071；3深圳華大基因研究院，深圳 518083

蠟樣芽胞桿菌是革蘭氏陽性桿菌，好氧或兼性厭氧并能形成孢子，是一種條件致病菌，能產(chǎn)生三種不同的腸毒素，引起嘔吐綜合征和腹瀉[1-3]。宇宙空間站中普遍存在蠟狀芽孢桿菌，宇航員的食物容易受到蠟狀芽孢桿菌的污染[4]。因此研究空間誘變的蠟狀芽孢桿菌對(duì)空間駐留人員的健康具有重要意義。本研究利用神州八號(hào)飛船實(shí)驗(yàn)平臺(tái)搭載蠟狀芽孢桿菌進(jìn)行實(shí)際天基實(shí)驗(yàn)，對(duì)返回地面后的菌株進(jìn)行了蛋白質(zhì)組檢測(cè)，以期發(fā)現(xiàn)空間環(huán)境對(duì)蠟狀芽孢桿菌的影響。

材料和方法

1 菌株選擇 蠟狀芽孢桿菌來源于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)，菌株號(hào)CGMCC 1.230。將此菌株搭載神州八號(hào)飛船飛行398 h后返回地面，分離出LCT-BC25和LCT-BC235兩株空間誘變菌株。同時(shí)地面做相應(yīng)溫度對(duì)照株培養(yǎng)，命名為L(zhǎng)CT-BC244。經(jīng)細(xì)菌分型鑒定LCT-BC244的16S rRNA基因序列與蠟狀芽孢桿菌14 579 100%相似。

2 蛋白質(zhì)組檢測(cè) 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)定量蛋白組學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法[5]。首先從3組樣品中提取細(xì)菌蛋白質(zhì)，進(jìn)行還原烷基化處理，打開二硫鍵以便后續(xù)充分酶解蛋白。用GE公司的2D quant kit法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。等體積進(jìn)行十二烷基磺酸鈉(SDS)電泳后進(jìn)行酶解蛋白。用iTRAQ試劑標(biāo)記肽段，將標(biāo)記后的肽段進(jìn)行等量混合，使用強(qiáng)陽離子交換色譜(strong cation exchange choematography，SCX)進(jìn)行預(yù)分離。最后進(jìn)行液相串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析。

3 生物信息分析 對(duì)于質(zhì)譜下機(jī)的原始文件進(jìn)行峰識(shí)別，得到峰列表。建立參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行肽段及蛋白質(zhì)鑒定。所有鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行COG功能分析、GO功能分析和KEGG通路分析。最后比較各蛋白在各樣品之間的相對(duì)含量，從而獲得一些感興趣的重要蛋白。本研究中當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)定量值同時(shí)滿足以下條件視為最終的差異蛋白：1)進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，某個(gè)蛋白至少出現(xiàn)在2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中；2)蛋白豐度差異倍數(shù)＞1.2倍；3)經(jīng)多重假設(shè)檢驗(yàn)(multiple hypothesis testing)，其P＜ 0.05。

結(jié) 果

1 蛋白質(zhì)組鑒定 3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)共得到418 896張譜圖，11 453個(gè)肽段。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫匹配后得到1 501個(gè)蛋白質(zhì)。取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)≥2的蛋白質(zhì)作為最終鑒定到的可能蛋白質(zhì)。最終得到1 269個(gè)可能蛋白質(zhì)。

2 功能分析 對(duì)1 269個(gè)可能的蛋白質(zhì)進(jìn)行COG功能分析發(fā)現(xiàn)，80%以上的蛋白質(zhì)分布于能量的生成和轉(zhuǎn)換、氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、翻譯過程和核糖體的結(jié)構(gòu)和生物合成、轉(zhuǎn)錄過程、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(圖1)。GO功能分析發(fā)現(xiàn)，大部分蛋白的功能與代謝活性和細(xì)胞學(xué)過程相關(guān)(圖2)。KEGG代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白大都與細(xì)菌的代謝過程和次級(jí)代謝相關(guān)。

3 蛋白定量分析 兩株經(jīng)空間誘變的蠟狀芽孢桿菌與地面對(duì)照株比較，差異表達(dá)蛋白的分布情況如圖3所示。該圖顯示了三次重復(fù)中蛋白定量平均值分布情況，其中橫坐標(biāo)表示差異倍數(shù)經(jīng)過以2為底數(shù)的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后的值。＞0的為表達(dá)量上調(diào)，＜0的為表達(dá)量下調(diào)。其中LCTBC25與地面對(duì)照株LCT-BC244比較有57個(gè)蛋白上調(diào)，77個(gè)蛋白下調(diào)；LCT-BC235與地面對(duì)照株LCT-BC244比較有8個(gè)蛋白上調(diào)，73個(gè)蛋白下調(diào)。

圖1 COG分類不同功能的蛋白質(zhì)的統(tǒng)計(jì)數(shù)量Fig. 1 Proteins with different functions according to COG

圖2 GO功能分析各條目數(shù)量占總蛋白數(shù)量的百分比Fig. 2 Number of proteins/total number of proteins (%) according to GO

圖3 空間誘變蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25 (左)和LCT-BC235 (右)蛋白質(zhì)豐度分布圖Fig. 3 Protein abundance distribution in space environment-induced LCTBC25 strain (left) and LCT-BC235 strain (right)

表1 空間誘導(dǎo)蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25差異表達(dá)蛋白Tab. 1 Differentially expressed proteins of space environment-induced LCT-BC25 strain

表2 空間誘導(dǎo)蠟狀芽孢桿菌LCT-BC235差異表達(dá)蛋白Tab. 2 Differentially expressed proteins of space environment-induced LCT-BC235 strain

4 差異表達(dá)蛋白 在上述分析的基礎(chǔ)上，分別從LCT-BC25和LCT-BC235中篩選出最具差異的5個(gè)上調(diào)蛋白和5個(gè)下調(diào)蛋白(表1、表2)。LCTBC25和LCT-BC235差異蛋白的不同說明空間突變的不定向性。差異蛋白大都是一些代謝活性和調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白。LCT-BC235的溶血性腸毒素高表達(dá)，提示其毒力和致病力可能增強(qiáng)。

討 論

既往關(guān)于微重力對(duì)細(xì)菌致病性的影響研究最多的是腸道沙門氏菌。多個(gè)研究都表明經(jīng)過空間環(huán)境誘導(dǎo)后沙門菌的毒力增強(qiáng)[6-7]。此外，Chopra等[8]使用雙向凝膠電泳檢測(cè)方法來探討微重力致細(xì)菌毒力改變的機(jī)制，研究在模擬微重力條件下對(duì)大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。其研究發(fā)現(xiàn)，模擬微重力暴露后的致病性大腸桿菌，74種蛋白表達(dá)升高，18種蛋白表達(dá)不足，新表達(dá)的蛋白有62種。而對(duì)于鼠傷寒沙門氏菌則分別為35種、33種和57種。通過Northern Blot方法發(fā)現(xiàn)暴露于模擬微重力條件下的產(chǎn)毒性大腸桿菌編碼毒力因子LT-1的基因發(fā)生上調(diào)。但目前空間微生物學(xué)相關(guān)研究的研究尚處于起步階段，關(guān)于微重力致細(xì)菌毒力改變的機(jī)制仍不明確。對(duì)于同為腸內(nèi)常駐菌群的蠟狀芽孢桿菌未有研究報(bào)道。對(duì)病原微生物進(jìn)行蛋白組學(xué)研究有利于從分子層面揭示相關(guān)的致病機(jī)制，闡明疾病的發(fā)病機(jī)理[9]。尤其是空間極端環(huán)境能夠?qū)е录?xì)菌的致病力和毒性發(fā)生改變，對(duì)空間飛行后的菌株進(jìn)行相關(guān)研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[10-11]。

蠟樣芽胞桿菌與少數(shù)食物中毒有關(guān)(約2%~5%)，這是由于蠟狀芽孢桿菌產(chǎn)生腸毒素，人食用含毒素的食物產(chǎn)生一系列包括嚴(yán)重的惡心、嘔吐以及腹痛腹瀉等不良反應(yīng)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過搭載神舟八號(hào)飛船空間誘變后的蠟狀芽孢桿菌大部分鑒定到的蛋白質(zhì)屬于代謝相關(guān)蛋白，可見在空間環(huán)境的誘導(dǎo)下細(xì)菌通過自身代謝水平的調(diào)節(jié)發(fā)生對(duì)空間極端環(huán)境的適應(yīng)性過程。經(jīng)過空間誘變后，兩株蠟狀芽孢桿菌均出現(xiàn)了明顯差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，但是這兩株細(xì)菌差異表達(dá)的蛋白質(zhì)譜明顯不同，說明了空間突變的不定向性?？臻g誘變蠟狀芽孢桿菌LCT-BC25主要的差異蛋白與代謝調(diào)節(jié)水平相關(guān)；而LCT-BC235除了有代謝相關(guān)蛋白改變，還出現(xiàn)了溶血性腸毒素蛋白的明顯高表達(dá)，提示這株細(xì)菌可能有較強(qiáng)的毒力，極有可能對(duì)空間站航天員造成潛在的危害。但目前對(duì)于該溶血性腸毒素基因的相關(guān)研究較少，有待于進(jìn)一步研究該基因改變的意義和相關(guān)的致病機(jī)制。

本研究是一個(gè)對(duì)空間環(huán)境下蠟狀芽孢桿菌的蛋白質(zhì)組進(jìn)行測(cè)序和分析的實(shí)驗(yàn)研究，這為揭示蠟狀芽孢桿菌在空間的變化和毒力改變奠定了基礎(chǔ)，為后期我國(guó)空間站的建立和宇航員的健康提供了保障。

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