常 德，劉進(jìn)文，方向群，李天志，王俊鋒，郭英華，徐國(guó)綱，蘇龍翔，姜學(xué)革，劉 巖，王雅娟，陳振鴻，王 立，劉長(zhǎng)庭

1解放軍總醫(yī)院 南樓呼吸科，北京 100853；2深圳華大基因研究院，廣東深圳 518083

隨著我國(guó)載人航天事業(yè)的發(fā)展和空間站建設(shè)計(jì)劃的實(shí)施，航天醫(yī)學(xué)保障日益重要。在航天活動(dòng)中，航天員體內(nèi)微生物可隨航天員進(jìn)入太空，微重力、強(qiáng)輻射、弱磁場(chǎng)和極端溫度等特殊空間環(huán)境可影響微生物的生物學(xué)特性，誘導(dǎo)細(xì)菌致病性改變，使航天員的感染風(fēng)險(xiǎn)增加[1-2]。屎腸球菌是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，屬于腸球菌屬，是人類(lèi)胃腸道的常駐菌群[3-4]，是哺乳動(dòng)物胃腸道內(nèi)無(wú)害的共生菌[5]，被用作為益生菌加入到發(fā)酵食品中[6]。然而，某些腸球菌已被確認(rèn)為能引起感染的條件致病菌[7-8]，可導(dǎo)致人體多系統(tǒng)感染。為了解空間環(huán)境對(duì)屎腸球菌生物學(xué)特性的影響，本研究以神舟八號(hào)飛船搭載的屎腸球菌為研究對(duì)象，篩選空間環(huán)境誘導(dǎo)的屎腸球菌突變株，并通過(guò)差異蛋白學(xué)研究空間環(huán)境誘導(dǎo)突變株出現(xiàn)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，分析空間環(huán)境因素對(duì)屎腸球菌的影響機(jī)理，為保障航天員的健康和在軌安全提供理論基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料 屎腸球菌購(gòu)自中國(guó)菌種保存中心，保藏號(hào)為CGMCC1.2136，表型篩選Biolog生化反應(yīng)板GEN III MicroPlate TM來(lái)自美國(guó)Biolog公司，蛋白濃度測(cè)定BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo fish公司，iTRAQ試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

2 空間環(huán)境誘導(dǎo)屎腸球菌突變株的篩選 神舟八號(hào)飛船返回地面后，取出搭載的屎腸球菌，在LB瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，挑選單克隆菌株接種在LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后取2 ml菌液6 000 r/s離心5 min，棄上清，用0.9%氯化鈉注射液洗滌菌體，6 000 r/s離心5 min，棄上清后用Biolog接種液進(jìn)行懸浮菌體，濃度107~108，震蕩均勻，向每個(gè)Biolog板孔加樣100μl，共96孔，放置在37℃下培養(yǎng)，24 h和48 h進(jìn)行觀察。

3 總蛋白提取、烷基化處理和濃度測(cè)定 總蛋白裂解液：50 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，0.5% Triton X-100，pH值8.5~9.0；用前加入100μg/ml溶菌酶、1μl/ml的蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)。12 000 g，4℃下離心菌液15 min收集菌體，用PBS懸浮洗滌2遍，加入1 ml配制好的裂解液懸浮菌體；采用300 W、10 s超聲，間隔10 s，超聲20 min后，1 000 g/min離心去掉大碎片，進(jìn)行還原烷基化處理，打開(kāi)二硫鍵充分酶解蛋白。根據(jù)BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)，按2 000μg、1 000μg、500μg、250μg、125μg、62.5μg、31.25μg、0μg的標(biāo)準(zhǔn)品蛋白量加入微孔板，每種濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，同時(shí)樣品蛋白按照不同量加入微孔板，各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30 min后，在562 nm下測(cè)定管吸收值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白濃度，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

4 同重同位素相對(duì)與絕對(duì)定量(isobaric tags for relativeand absolute quantitation，iTRAQ)定量蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn) 根據(jù)iTRAQ定量蛋白質(zhì)組分析試劑盒說(shuō)明，加入蛋白酶，使蛋白消化成不同的肽段，用iTRAQ試劑標(biāo)記肽段，并進(jìn)行等量混合，使用強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜(strong cation exchange choematography，SCX)進(jìn)行預(yù)分離。最后進(jìn)行液相串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析。

5 蛋白質(zhì)鑒定 通過(guò)iTRAQ定量分析的一級(jí)譜圖和二級(jí)拼圖，分別鑒定肽段和蛋白質(zhì)數(shù)量，通過(guò)比對(duì)地面對(duì)照屎腸球菌基因組測(cè)序注釋到的蛋白質(zhì)，每種樣品重復(fù)3次，繪制3次重復(fù)之間鑒定到的蛋白質(zhì)重疊圖，并分析肽段序列長(zhǎng)度分布、肽段序列覆蓋度和肽段數(shù)量分布。以3次重復(fù)之間有2次或以上重復(fù)鑒定到的蛋白質(zhì)確定為最終鑒定到的蛋白質(zhì)，并進(jìn)行下一步的蛋白質(zhì)定量分析。

6 蛋白質(zhì)定量分析 在iTRAQ定量分析中，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)定量值滿(mǎn)足下面兩個(gè)條件，視為單次重復(fù)間的差異蛋白；在3次重復(fù)中至少2次重復(fù)達(dá)到以下要求時(shí)，視為最終差異蛋白。1)蛋白豐度差異倍數(shù)超過(guò)1.2倍以上；2)經(jīng)多重假設(shè)檢驗(yàn)P＜0.05。同時(shí)分析蛋白質(zhì)豐度比分布，在相對(duì)定量時(shí)如果同一個(gè)蛋白質(zhì)的量在兩個(gè)樣品間沒(méi)有顯著變化，那么其蛋白質(zhì)豐度比接近于1。當(dāng)?shù)鞍棕S度比即差異倍數(shù)達(dá)到1.2倍以上，且經(jīng)假設(shè)檢驗(yàn)P＜0.05，視該蛋白為不同樣品間的差異蛋白。對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)差異倍數(shù)以2為底取對(duì)數(shù)后作出分布。

7 差異蛋白注釋分析 當(dāng)?shù)鞍椎呢S度比即差異倍數(shù)＞1.5倍，且經(jīng)多重檢驗(yàn)P＜0.05，視該蛋白為空間組和地面對(duì)照組間的差異蛋白。把所有差異蛋白質(zhì)向Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)的各個(gè)條目映射，計(jì)算每個(gè)條目的蛋白質(zhì)數(shù)目，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)找出與所有蛋白質(zhì)背景相比在差異蛋白質(zhì)中顯著富集的GO條目。

結(jié) 果

1 空間環(huán)境誘導(dǎo)屎腸球菌突變株的篩選 采用Biolog生化反應(yīng)板篩選到空間環(huán)境誘導(dǎo)的屎腸球菌LCT-EF18突變株，LCT-EF90菌株為地面對(duì)照屎腸球菌菌株，Biolog反應(yīng)板上3個(gè)孔顯示出不同的顏色反應(yīng)，見(jiàn)圖1，分別是空間誘變株能利用底物肌酐和L-蘋(píng)果酸，而不能利用對(duì)羥基苯乙酸(表1)，表明經(jīng)過(guò)太空飛行后得到的LCT-EF18發(fā)生了生物學(xué)性狀的改變。

2 總蛋白提取和蛋白質(zhì)濃度測(cè)定 提取總蛋白并進(jìn)行烷基化處理后，利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，從標(biāo)準(zhǔn)品BSA濃度為橫坐標(biāo)，562 nm波長(zhǎng)的光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線的R方值為0.990 3，表明濃度和光吸收值間的線性關(guān)系較好(圖1)，從而推算出蛋白濃度的計(jì)算公式為X=(Y-0.213 7)/0.001 2。將樣品變形后進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測(cè)(圖2)。

3 蛋白質(zhì)鑒定 3次重復(fù)都包括的有1 027個(gè)蛋白，2次重復(fù)均鑒定到的有425個(gè)蛋白，其鑒定到1 452個(gè)蛋白質(zhì)(圖3)，肽段序列長(zhǎng)度分布在10個(gè)氨基酸左右，80%的蛋白質(zhì)肽段序列覆蓋度超過(guò)10%，覆蓋11個(gè)肽段的蛋白數(shù)量在590個(gè)以上。

4 蛋白質(zhì)定量分析 同地面對(duì)照組相比，空間環(huán)境誘導(dǎo)突變株出現(xiàn)50個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，74個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào)(圖4)。蛋白質(zhì)豐度分布見(jiàn)圖5，橫坐標(biāo)表示差異倍數(shù)經(jīng)過(guò)以2為底數(shù)的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后的值，＞0為表達(dá)量上調(diào)，＜0為表達(dá)量下調(diào)。

5 差異蛋白的GO功能注釋分析 GO功能總共有三個(gè)本體(ontology)，分別描述基因的分子功能(molecular function)、所處的細(xì)胞位置(cellular component)、參與的生物過(guò)程(biological process)，表明空間環(huán)境能影響屎腸球菌能量代謝、核苷酸合成和大分子的催化，此類(lèi)差異表達(dá)蛋白參與的生物過(guò)程見(jiàn)表2。

圖1 用于蛋白定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve for quantifying protein concentrations

圖2 屎腸球菌菌株總蛋白SDS-PAGE電泳檢測(cè)Fig. 2 SDS-PAGE of total protein in E. faecium strain

圖3 三次重復(fù)之間鑒定到的蛋白質(zhì)重疊圖Fig. 3 Overlap of identified proteins among 3 replications

圖4 差異蛋白數(shù)量統(tǒng)計(jì)Fig. 4 Number of different proteins

圖5 蛋白質(zhì)豐度分布(LCT-EF20和LCT-EF90)Fig. 5 Protein distribution detected by LCT-EF20-VS-LCT-EF90

表1 LCT-EF20和LCT-EF90菌株的底物利用差異Tab. 1 Different utilization of substrates between LCTEF20 and LCT-EF90

表2 差異蛋白的GO富集分析Tab. 2 Gene ontology enrichment analysis of different proteins

討 論

空間站上最大的微生物庫(kù)是航天員腸內(nèi)的常駐菌群，過(guò)去關(guān)于微重力對(duì)細(xì)菌致病性的影響多集中在沙門(mén)氏菌和大腸桿菌。將暴露于模擬微重力環(huán)境或真實(shí)空間環(huán)境的沙門(mén)氏菌感染小鼠后，其感染后的死亡率與對(duì)照組相比明顯增加[9-10]。因此，開(kāi)展空間環(huán)境因素對(duì)病原菌的作用效應(yīng)和機(jī)理研究意義重大。

屎腸球菌早期被認(rèn)為屬于D群鏈球菌屬[11]，隨著分子生物學(xué)各項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)基因DNA的同源性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其屬于腸球菌屬。腸球菌是人體內(nèi)的一種正常菌群，但在人體免疫力下降時(shí)同樣可以致病，因此是一種條件性致病菌，?？蓪?dǎo)致多個(gè)系統(tǒng)發(fā)生感染，例如人體生殖系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、腹腔感染、傷口表面感染等，同時(shí)也是引起院內(nèi)感染的常見(jiàn)菌群之一[2,7]。

本研究利用Biolog生化反應(yīng)篩選搭載神舟八號(hào)飛船飛行的屎腸球菌突變株，通過(guò)最新一代的質(zhì)譜技術(shù)對(duì)屎腸球菌空間突變株進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，鑒定經(jīng)過(guò)太空飛行后的發(fā)生表達(dá)改變的屎腸球菌蛋白，我們發(fā)現(xiàn)有124個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)的改變，其中包括50個(gè)表達(dá)增加的蛋白和74個(gè)表達(dá)下調(diào)的蛋白，經(jīng)過(guò)GO功能的注釋分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要參與大分子催化、ATP 生物合成、嘌呤核苷生物合成、ATP代謝和嘌呤核苷酸生物合成等過(guò)程，這些主要同細(xì)菌的能量和物質(zhì)代謝有關(guān)，也可能同細(xì)菌致病性和耐藥性相關(guān)。我們后續(xù)將進(jìn)一步研究這些表達(dá)改變的蛋白質(zhì)功能，尤其是同細(xì)菌致病力相關(guān)的蛋白。

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