劉美蘭，譚曉風，龍洪旭，張 琳，周俊琴，王建勇

(中南林業(yè)科技大學 經濟林培育與保護教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004)

油桐(Vernicia fordii)是我國南方重要的木本油料經濟樹種[1]。油桐的種子含油率高(50% ～70%)，它具有優(yōu)異的防水、絕緣、防腐蝕性能，是重要的工業(yè)油料，還可做燃料及生物柴油[2，3]。目前，國內外對油桐的研究主要集中在栽培選優(yōu)及豐產林改造方面，分子水平的研究報道較少，龍洪旭等[4-5]對個別基因進行了克隆，譚曉風等[6]構建了油桐種子EST文庫構建。本文中以葡萄桐近成熟種子為材料，在轉錄組數據庫的基礎上，開展對油桐優(yōu)質基因資源的分離克隆研究，為油脂合成進行遺傳改良提供資源和技術基礎。

β-酮脂酰-ACP還原酶(KAR)又名β-氧脂酰-ACP還原酶，，催化乙酰乙酰-ACP還原成β-羥脂酰-ACP，該酶的天然底物是乙酰乙酰-ACP，但同時也能利用?；鵆oA和?；腚装贰Ｔ冖蛐椭舅岷铣赏緩街?，KAR是唯一催化酮脂酰還原反應的酶[7-8]。根據與NADH不同的作用方式，植物β-酮脂酰-ACP還原酶分2種等位形式:一種是依賴NADPH的酶，已從油菜、大麥葉、菠菜葉，紅花種子、眼蟲和鱷梨中果皮中克隆出來，其中從油菜、鱷梨中分離的還原酶是NADHP特異的，它的N-端有細胞色素f結構域，內部還有1個類似NodG基因的產物，其編碼基因已從擬南芥、油菜中克隆，它的N-端編碼區(qū)編碼1個可將多肽定位于質體基質的轉運肽[9-10]。另一種是與NADH相聯(lián)結的酶，催化β-酮脂酰-ACP還原，已從鱷梨中果皮的質體和眼蟲純化，至于在脂肪酸合成中的作用尚不清楚。Klein等[11]的雜交研究表明，在披針葉萼距花(CwpAea lanceolata)中β-酮脂酰-ACP還原酶由一個至少有兩個基因的小基因家族編碼，并且這個家庭的成員在根、葉、花和種子中都表達。兩種等位形式的β-酮脂酰-ACP還原酶共同控制脂肪酸合成的第一個還原反應，對脂肪酸合成有極其重要的作用。因此，油桐KAR基因的克隆與生物學信息分析將為進一步調控油桐脂肪酸生物合成提供物質基礎，并為油桐KAR基因的利用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物材料 2012年8月底在湖南省永順縣青坪鎮(zhèn)中南林業(yè)科技大學油桐試驗基地，即國家油桐種質資源保存庫采集葡萄桐近成熟種子為實驗材料，保存于-80℃冰箱中備用。

1.1.2 實驗試劑 實驗所有試劑名稱和來源如下表1。

表1 實驗試劑名稱和來源Tab.1 Experimental reagents name and origin

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成 采用Invitrogen公司的PureLinkTMRNA Mini Kit試劑盒、CTAB裂解和氯仿/異戊醇抽提的綜合方法提取油桐種子內的總RNA。使用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的提取效果。反轉錄反應根據TaKaRa公司cDNA合成試劑盒說明書完成，從而得到第一條鏈cDNA，以此為模板進行PCR擴增。

1.2.2 油桐KAR基因的克隆 從油桐種子轉錄組測序結果中獲得KAR1和KAR2的全長序列，它們的開放閱讀框長分別為993 bp和900 bp。依據2條Unigene序列利用Primer Premier 5軟件設計引物(表2)，以葡萄桐近成熟種子反轉錄的單鏈cDNA為模板，進行PCR擴增。反應體系及引物序列如表3?；厥誔CR產物并連入pEASY-Blunt Simple載體連接，轉化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細胞，在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上進行陽性篩選，選擇陽性克隆送北京六合華大基因公司測序。將獲得的基因序列分別命名為Vf_KAR1和Vf_KAR2。

表2 油桐KAR全長引物序列Tab.2 Primer sequence of Vernicia fordii KAR

表3 油桐KAR全長擴增PCR反應體系和反程序列Tab.3 PCR amplification reaction and response procedures of Vernicia fordii KAR

1.2.3 生物信息學分析 通過 NCBI進行在線BLASTX分析，對克隆基因進行功能確定;用在線多工具Clustalw2、Vector NTI 10.3.0和GENDOC軟件進行同源性分析，并用軟件MEGA5.1構建Neighborjoining系統(tǒng)進化樹;利用在線軟件ProtParam、SignalP4.1和TargetP 1.1 Server對編碼蛋白分別進行了理化性質分析、信號肽和導肽性分析;采用在線ProtScale、TMpred Server和Mobyle portal分別進行編碼蛋白的疏水性、跨膜結構和跨膜區(qū)拓撲結構預測;同時，利用在線工具SOPMA和EsyPred3Dwebserver1.0分別進行二維結構和三維結構的預測，并利用本地軟件UCSF Chimera對三維結構進行分析。

2 結果與分析

2.1 油桐Vf_KAR1和Vf_KAR2基因的克隆與序列分析

根據測序結果比對分析，Vf_KAR1(Unigene1369_All)全長為1 449 bp(圖1-A)，其中5'UTR長為128 bp，3'UTR長為328 bp，CDS長為993 bp，推測其編碼331個氨基酸;Vf_KAR2(Unigene9987_All)全長為1 086 bp(圖1-B)，其中5'UTR長為17 bp，3'UTR長為3 bp，CDS長為900 bp，推測其編碼300個氨基酸。將Vf_KAR1和Vf_KAR2進行BLASTX分析后共搜索到100多條相似度很高的KAR同源序列，因此可以判斷Vf_KAR1和Vf_KAR2的CDS均為β-酮脂酰-ACP還原酶(KAR)基因。

圖1 油桐KAR擴增結果Fig.1 Amplification results of Vernicia fordii KAR

利用在線工具Clustalw2將推導出的Vf_KAR1和Vf_KAR2氨基酸序列與其他物種的KAR氨基酸進行多重序列比對分析，結果顯示這些基因所編碼的氨基酸序列具有較高的相似性，各物種之間的同源性在62% ～82%，油桐Vf_KAR1和Vf_KAR2相似性僅有74%，Vf_KAR1與蓖麻的相似度最高，達82%;Vf_KAR2基因與花生、辣椒的相似度高達76%。通過GENDOC軟件序列比對和在線Predictprotein序列分析結果還顯示，各物種所編碼的氨基酸都存在高度保守的“Ser-tyr-Lys”三聯(lián)體催化中心(圖2羅馬數字Ⅲ)，這是短鏈脫氫還原酶家族的主要特征之一。同時，在氨基酸序列中存較多的酰基化位點，此外還有糖基化位點、蛋白激酶C和酪蛋白激酶介導的磷酸化位點(圖2)。用軟件MEGA5.1構建進化樹，發(fā)現(xiàn)Vf_KAR1與蓖麻處于同一進化枝上，進化關系最為接近，Vf_KAR2找不到與其同一進化枝的植物(圖3)。

圖2 不同物種KAR氨基酸序列比對結果Fig.2 Amino acid sequences alignment of KAR from different species

圖3 不同物種KAR種系進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of KARs from different species

2.2 油桐Vf_KAR1和Vf_KAR2基因編碼蛋白的理化性質分析

利用在線ProtParam對Vf_KAR1和Vf_KAR2基因編碼的蛋白質進行了理化性質分析，結果表明:Vf_KAR1和Vf_KAR2所形成的蛋白分子量分別為35 kD和32 kD;等電點為9.28和9.11;理論推導半衰期都為30 h;編碼蛋白的原子組成分別為C1536H2506N432O466S13和C1410H2289N393O421S13;不穩(wěn)定系數是33.52和32.12，由此說明這兩個蛋白是穩(wěn)定性蛋白;脂肪系數為93.72和95.93，總平均親水性分別為0.095和0.108，說明這兩個蛋白的疏水性較弱。

2.3 信號肽和導肽的預測和分析

信號肽(signal peptide)常位于蛋白N端，由可被剪切的15～30個氨基酸的前導序列組成。當被轉運的蛋白質肽鏈的合成在mRNA起始密碼上啟動后，首先合成帶有信號肽的蛋白，信號肽被內質網膜上的受體蛋白所識別并相互結合，此時受體蛋白可聚合而產生膜內通道，信號肽引導蛋白經過通道進入內質網，隨后信號肽被膜內側的信號肽酶水解，蛋白質隨之變?yōu)槌墒斓鞍踪|。導肽又稱轉運肽(transit peptide)或導向序列(targeting sequence)，它是游離核糖體上合成的新生蛋白N端長約20～80個氨基酸殘基的肽鏈，通常為帶正電荷的堿性氨基酸，精氨酸和賴氨酸含量較為豐富，具有引導附著序列進入線粒體或葉綠體靶位點的功能，因此導肽的預測和分析對研究蛋白質的定位具有重要作用[12]。利用SignalP4.1對油桐Vf_KAR1和Vf_KAR2基因的氨基酸序列進行在線信號肽預測，綜合各項指標表明兩條序列都不含信號肽。使用在線TargetP 1.1 Server分析油桐Vf_KAR1和Vf_KAR2基因的氨基酸序列導肽性，結果分析表明兩條序列都含有葉綠體轉運肽的RC值分別為1和5。RC是可靠性等級，是一個衡量最高和第二得分最高輸出之間的差異，較低的RC價值的預測更安全，因此，可推測油桐Vf_KAR1和Vf_KAR2都含有葉綠體轉運肽。預測結果與報道的其他物種KAR基因((如油菜Brassicanopus)結構一致[12]。

2.4 油桐Vf_KAR1和Vf_KAR2基因編碼蛋白的疏水性/親水性的預測和分析

氨基酸序列決定蛋白質的功能，組成蛋白質的20種氨基酸各具特殊的側鏈，當它們按照不同的序列關系組合時，就可形成多種多樣的空間結構，使其具有不同生物學活性。疏水性是20種氨基酸都固有的特性，是影響蛋白質構象的重要因素，因此蛋白質疏水性/親水性的預測和分析，對預測蛋白質生物學功能具有重要意義[13]。利用在線ProtScale分析預測Vf_KAR1和Vf_KAR2編碼蛋白的疏水性，參照其數字文本格式分析發(fā)現(xiàn)Vf_KAR1和Vf_KAR2分別有161個和150個疏水性氨基酸殘基，分別占各自總殘基數的49.8%和51.4%，編碼的氨基酸序列中親水性氨基酸、疏水性都均勻分布在各個肽鏈中，綜合Vf_KAR1和Vf_KAR2的脂肪系數與總平均親水性來分析，可推測Vf_KAR1和Vf_KAR2基因編碼的蛋白是疏水性蛋白，且Vf_KAR2比Vf_KAR1的疏水性較強。

2.5 Vf_KAR1和Vf_KAR2基因編碼蛋白的跨膜結構與拓撲結構預測

利用在線TMpred Server和Mobyle portal對Vf_KAR1和Vf_KAR2進行跨膜結構和跨膜區(qū)拓撲結構預測結果(圖4，圖5)顯示:Vf_KAR1僅有1個跨膜域和1個疑似跨膜域，Vf_KAR僅有2個疑似跨膜域。每個跨膜結構域由20個氨基酸殘基組成的螺旋，同時兩條序列的跨膜蛋白N端和C端都位于細胞膜胞質的同一側。

圖4 Vf_KAR1的跨膜拓撲結構預測Fig.4 Predicted transmembrane topology of Vf_KAR1

圖5 Vf_KAR2的跨膜拓撲結構預測Fig.5 Predicted transmembrane topology of Vf_KAR2

2.6 油桐Vf_KAR1和Vf_KAR2基因編碼蛋白二級結構及三級結構的預測

利用在線工具SOPMA軟件預測Vf_KAR1和Vf_KAR2氨基酸序列的二級結構，結果顯示Vf_KAR1蛋白殘基組成為:α-螺旋(h)為40.79%、β-折疊(e)為21.75%、β-轉角(t)為9.97%、隨機卷曲(c)為27.49%;Vf_KAR2的 α-螺旋(h)為44.00%、β-折疊(e)為19.67%、β-轉角(t)為9.33%、無規(guī)卷曲(c)為27.00%。通過比較分析，Vf_KAR1和Vf_KAR2氨基酸序列的二級結構較為相似。

根據PDBsum數據庫，對Vf_KAR1和Vf_KAR2三維結構數據庫搜索已知的蛋白分子模板，結果顯示Vf_KAR1和Vf_KAR2與Brassica napus.Rape的晶體結構(pDB:1edoA)最為相似，相似度達85.2%和81.07%，E-value=1.19e-107 和5.20e-104(圖 6)。

圖6 預測的Vf_KAR1和Vf_KAR2三級結構模板Fig.6 Predicted tertiary structure template of Vf_KAR and Vf_KAR2

利用EsyPred3Dwebserver1.0在線軟件對Vf_KAR1和Vf_KAR2進行三維結構預測，并利用本地軟件UCSF Chimera進行結構分析顯示:Vf_KAR1和Vf_KAR2單體結構呈現(xiàn)典型的Rossmann折疊特征(如圖7)。預測的Vf_KAR1和Vf_KAR2單體三維結構基本相似，它們都由10個α螺旋和7個β折疊組成，其中7個纏繞平行的β折疊分布于10個α螺旋的兩側，它們的結構中心由兩個右手螺旋的βαβαβmotif組成。從疏水表面立體圖可以看到酶的整個輪廓(圖8)，其中橘黃色為α螺旋，占主要部分。這些結構與β-酮脂酰-ACP還原酶發(fā)揮催化作用有著密切的關系。

圖7 Vf_KAR1和Vf_KAR2彩帶立體圖Fig.7 Ribbons stereogram of Vf_KAR1 and Vf_KAR2

圖8 Vf_KAR1和Vf_KAR2疏水表面立體圖Fig.8 Hydrophobic surface graphic model ofVf_KAR1 and Vf_KAR2

3 結論與討論

β-酮脂酰-ACP還原酶是唯一催化酮脂酰還原反應的酶，在植物脂肪酸合成途徑中起著極其重要的作用，目前對植物β-酮脂酰-ACP還原酶基因的研究較少。本文根據實驗室構建的油桐3個時期轉錄組數據分析，以葡萄桐近成熟種子為材料，擴增克隆了2個β-酮脂酰-ACP還原酶基因，命名并在GenBank數據庫中登錄，分別為Vf_KAR1和Vf_KAR2。經生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，本實驗獲得的2個β-酮脂酰-ACP還原酶均無信號肽，但都有葉綠體轉運肽;它們都為疏水性蛋白，都有典型的活化中心三聯(lián)體(Ser-Tyr-Lys);它們的三級結構都有典型的Rossmann折疊特征;此外，它們的理化特性、拓撲結構及其二級結構也極相似，因此，推測Vf_KAR1和Vf_KAR2為油桐β-酮脂酰-ACP還原酶基因家族的兩個成員。β-酮脂酰-ACP還原酶基因在多種植物(B.rassican napus)[3]、細菌(M.tuberculosis等)[14-15]和頂復門原蟲(P.falciparum)[16]等生物中也發(fā)現(xiàn)了。它們都屬于短鏈脫氫還原酶(SDR)家族[17]，SDR家族的酶有一個相當保守的α/β折疊，它以Rossman折疊的形式存在，此外它在催化必需的質子傳遞系統(tǒng)中存在ser-Tyr-Lys三聯(lián)體活化位點，并且后期的結構信息解析中也揭示了ser-Tyr-Lys三聯(lián)體活化位點對β-酮脂酰-ACP還原酶的功能是極其重要的[18]。但是油桐β-酮脂酰-ACP還原酶基因家族成員的數量以及各成員的具體功能仍然有待驗證。下一步將繼續(xù)克隆β-酮脂酰-ACP還原酶基因家族的成員，利用真核表達、原核表達或RNA干擾技術，來分析該基因在油桐植物體內的生理功能，這為進一步研究油桐脂肪酸的生物合成與代謝調控提供了候選的基因資源。

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