鄒 娜，李 意，連芳青

(江西農(nóng)業(yè)大學 園林與藝術(shù)學院，江西 南昌 330045)

白芨(Bletilla striata)為蘭科白芨屬多年生草本植物，花期3—5月，其花紫紅色，花形奇特，是一種理想的耐蔭觀花地被植物，還可盆栽室內(nèi)觀賞或作切花材料供插花之用[1－2]。白芨不僅具有較高觀賞價值，亦是我國常用的中藥材之一，以干燥塊莖入藥，具有收斂止血、消腫生肌等功效[3]。此外，白芨莖中還含有較高的白芨膠，具有特殊的黏度特性，可作為增稠劑、混懸劑、保濕劑和助乳化劑等應(yīng)用于化妝品中，具有良好的效果[4]。

因其極高的觀賞藥用及經(jīng)濟價值，野生白芨遭到了無限制人工采挖。同時，由于白芨種子自然條件下繁殖困難，野生白芨資源急劇減少。白芨目前已被國家列為珍稀瀕危的保護植物[5]。在其野生資源日益減少的情況下，大力推廣人工栽培[2，6]、并探索其行之有效的快速繁殖技術(shù)，可在解決其由于資源短缺制約白芨產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的同時，實現(xiàn)對野生白芨資源的有效保護[7]。

白芨常規(guī)以分生繁殖為主，但分生繁殖系數(shù)低，生長周期較長，而且耗種量大，不宜進行大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)[8]。利用無菌播種技術(shù)，通過組織培養(yǎng)方法可以快速繁殖大量種苗，遠較分株繁殖快捷高效[9]。目前，雖然白芨組織培養(yǎng)和設(shè)施栽培等人工繁育關(guān)鍵技術(shù)得到了一定的發(fā)展，但是還沒有組織培養(yǎng)技術(shù)迅速推廣應(yīng)用的報道[7]。因此，本研究的目的在于建立一套簡單實用且易推廣的白芨組培快繁技術(shù)程序，為白芨的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展及對野生白芨資源的有效保護提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白芨成熟未開裂的長卵圓形蒴果、花莖和地下莖。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體滅菌 外植體材料首先用流水沖洗20 min，再用小毛刷蘸洗衣粉溶液輕輕刷洗其表面，用流水沖洗干凈。在超凈工作臺上，用體積分數(shù)為75%酒精溶液浸泡30 s，然后轉(zhuǎn)入1 g/L的HgCl2溶液中進行表面消毒6～10 min，再用無菌水沖洗6次，吸干表面水分?；◤角腥啥瞬⒖v切成2半切口向下接到培養(yǎng)基上;塊莖每個切成4～6份接到培養(yǎng)基上;蒴果縱切，將粉末狀的細微種子均勻地撒于培養(yǎng)基上。每種外植體每次均接30瓶培養(yǎng)基，做3次重復實驗。

1.2.2 原球莖誘導 以MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，采用完全隨機試驗設(shè)計方法，研究細胞分裂素(6－BA、KT)和生長素(2，4－D、NAA)對白芨原球莖誘導的影響。培養(yǎng)21 d后統(tǒng)計原球莖的誘導率。原球莖誘導率=誘導出的原球莖個數(shù)/接種的外植體個數(shù)(種子粒數(shù))。

1.2.3 壯苗生根培養(yǎng) 將分化出的小芽接入由不同濃度細胞分裂素6－BA和生長素NAA配比組成的9種培養(yǎng)基，研究白芨苗的生根數(shù)，根長，葉片數(shù)，葉長和葉寬，以取得白芨一步成苗的最適培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基設(shè)15瓶，每瓶均接入6株白芨小芽，培養(yǎng)30 d后，記錄各數(shù)據(jù)。

1.2.4 移栽 選擇生長勢旺盛，葉片數(shù)多且根系良好的瓶苗，打開瓶蓋，室內(nèi)或95%遮光率的大棚內(nèi)放置3～5 d，然后小心取出瓶苗，洗凈根上附著的培養(yǎng)基。采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計研究蛭石、珍珠巖、泥炭土+蛭石、泥炭土+珍珠巖四種基質(zhì)對白芨組培苗移栽成活的影響。栽苗后注意遮光率和提高空氣濕度，定期做好觀察記錄。30 d后分別在每個基質(zhì)中抽取50株有代表性的苗進行調(diào)查分析，測每組內(nèi)苗的成活率、植物球莖直徑、苗高、葉片數(shù)、葉寬。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)條件為:溫度(25±2)℃，光照1 800～2 500 lx，每天光照12 h;誘導和增殖生根培養(yǎng)均采用 MS培養(yǎng)基，蔗糖30 g/L，pH 6.5，瓊脂7 g/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的選擇

分別以白芨蒴果、花莖和地下莖為外植體進行組織培養(yǎng)，結(jié)果表明，不同外植體類型的污染率都是隨著消毒時間的增加而減少，培養(yǎng)1個月后，消毒滅菌10 min的白芨蒴果(種子)的成活率可高達96.67%，平均污染率僅為3.33%，顯著低于相同處理條件下的地下莖和花莖平均感菌率(表1)。此外，以白芨花莖和地下莖作為繁殖材料，培養(yǎng)一段時間后地下莖變綠隨后變褐色，花莖雖也有膨大的現(xiàn)象，但更換多種培養(yǎng)基和重復多次實驗均未誘導出愈傷組織或芽;而以白芨種子為培養(yǎng)材料，通過簡單培養(yǎng)即可誘導出白芨原球莖。由此可見，白芨組織培養(yǎng)以蒴果(種子)為外植體的培養(yǎng)效果最好。

表1 白芨不同外植體的消毒效果Tab.1 Disinfection effects of different explants of Bletilla striata

2.2 不同培養(yǎng)基對白芨原球莖誘導及芽分化的影響

白芨種子播種在誘導培養(yǎng)基上約1周后吸水膨脹，并由黃褐色變成淡綠色，進一步形成綠色小球體狀(即原球莖)。試驗結(jié)果表明(表2):在培養(yǎng)基MS+6－BA 1.0 mg/L+2，4－D 0.5 mg/L中，原球莖誘導率只有5%(處理1)。將處理1中0.5 mg/L的2，4－D改為等濃度的NAA(處理2)，可使原球莖的平均誘導率由5%提高到90%，提高了17倍。說明在1 mg/L細胞分裂素6－BA存在情況下，與2，4－D相比，NAA更有利于白芨原球莖的誘導。

當保持培養(yǎng)基中的2，4－D濃度(0.5 mg/L)不變，將處理1中1.0 mg/L的細胞分裂素6－BA改為等濃度的KT(處理4)，原球莖的平均誘導率則有5%提高到70%，提高了13倍。說明在0.5 mg/L 2，4－D存在情況下，與6－BA相比，KT更有利于白芨原球莖的誘導。而在NAA濃度(0.5 mg/L)一定的條件下，等濃度的細胞分裂素6－BA或KT處理，對白芨原球莖誘導效果相同(處理2和處理3)。

因此，在節(jié)約成本的情況下，僅采用MS+6－BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基(處理2)對白芨原球莖進行誘導，便能達到很好的效果。但與生長素2，4－D搭配時，KT比6－BA的誘導效果好(處理1和處理4)。

表2 不同細胞分裂素和生長素誘導白芨原球莖的結(jié)果Tab.2 Effects of different cytokinin and auxin on protocorm induction of Bletilla striata

在上述不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)約1個月后，原球莖頂部出現(xiàn)可見幼葉，不同培養(yǎng)基對白芨芽分化的誘導存在較明顯的差異。處理1中誘導的白芨小芽發(fā)黃，略見綠色，雖然處理4原球莖誘導率可以達到70%，但黃化現(xiàn)象較處理1更嚴重，繼續(xù)培養(yǎng)，芽分化的誘導效果很差。

處理2和3中原球莖誘導分化效果較好，其中處理3中的小苗每株平均有兩小葉，而處理2每株僅有一片小葉。就整齊度而言，處理3芽分化效果更好;就苗高而言，處理2和處理3誘導的白芨平均苗高分別為0.3 cm和0.5 cm。由此可見，對于白芨芽的分化誘導，處理3效果最好。

綜合考慮白芨原球莖誘導和芽分化的效果，篩選出白芨原球莖誘導及芽分化最適培養(yǎng)基配方為:MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L(處理3)，在該培養(yǎng)基中的原球莖平均誘導率可達90%，且誘導芽的分化效果最好。

2.3 不同培養(yǎng)基對白芨壯苗生根培養(yǎng)的影響

將分化出的小芽轉(zhuǎn)接入含不同濃度6－BA和NAA配比組成的9種培養(yǎng)基中，以篩選白芨最佳壯苗生根培養(yǎng)基配方。

表3 不同培養(yǎng)基對白芨壯苗及生根培養(yǎng)影響Tab.3 Effects of different media on lustihood and rooting culture induction of Bletilla striata

由表3可以看出:每株苗葉片數(shù)最多的4號培養(yǎng)基，其次是處理2，且其葉長和葉寬值都較大。處理2、3和7，處理4和5，處理6和8之間的實驗結(jié)果表明:在NAA濃度相同的條件下，植株葉片數(shù)、葉長和葉寬隨BA濃度的增加而減少。而在BA濃度相同的條件下(處理5和6，處理7、8和9)，植株葉片數(shù)、葉長和葉寬隨NAA濃度的增加有降低趨勢，NAA保持在0.5 mg/L更有利于植株生長。說明細胞分裂素與生長素只有以一定適宜濃度配比，白芨組織培養(yǎng)才能獲得較好的生長效果。

表4 不同基質(zhì)對白芨移栽成活的影響Tab.4 Effects of different matrix on survival of Bletilla striata after transplant

9種培養(yǎng)基中的苗都能生根，綜合考察苗的生根數(shù)和根長，效果較好的處理為3、4和5，其中生長的植株平均根數(shù)分別為:7.4 條、7.2 條和 6.6 條，平均根長分別為:2.23，1.54，2.50 cm。

本試驗采用的是壯苗和生根培養(yǎng)一步成苗的方法，對白芨壯苗培養(yǎng)效果較好的培養(yǎng)基為處理2和處理4，生根較好的培養(yǎng)基為處理3、4和5，所以壯苗培養(yǎng)和生根效果都較好的培養(yǎng)基為處理4，即:MS+6 － BA 0.45 mg/L+NAA 0.4 mg/L。

2.4 白芨組培苗煉苗移栽

從表4可以看出不同基質(zhì)移栽處理對白芨成活有不同的影響。總體上來說用蛭石作為基質(zhì)來移栽白芨的試管苗的生長能力較強，存活率可達95%以上;在成活苗的平均根數(shù)、植物球根直徑、苗高葉寬的數(shù)據(jù)對比分析中，可以得出用蛭石作為基質(zhì)的效果是最好的，而以珍珠巖作為基質(zhì)的移栽效果不理想。添加泥炭土的混合基質(zhì)對移栽效果也沒用明顯的改變。

3 討論與小結(jié)

本實驗以白芨種子為培養(yǎng)材料，通過簡單培養(yǎng)即可誘導出白芨原球莖并進行芽的分化，且壯苗培養(yǎng)與生根可同時進行，即一步成苗，既節(jié)約了繁殖成本和培養(yǎng)時間，且操作簡單易行便于推廣，符合市場要求(圖版)。前人在對白芨原球莖的誘導過程中，培養(yǎng)基中都不同程度的添加了馬鈴薯泥、香蕉泥和椰子汁等輔助成分[9]，而本實驗僅采用常規(guī)激素組合對其進行誘導，效果同樣顯著(表2)，所以在大量生產(chǎn)中，可以從節(jié)約繁殖成本及便于操作的角度考慮使用簡單培養(yǎng)基成分誘導白芨原球莖。

但是同大多數(shù)蘭科植物一樣，培養(yǎng)基中生長素與細胞分裂素的種類及濃度配比對白芨原球莖誘導及芽分化方向起著決定性的作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)生長素2，4－D不僅抑制白芨原球莖的誘導，也不適宜于其原球莖的分化。而等濃度的NAA與KT或6－BA的配合使用對白芨原球莖的誘導效果很好(表2)。在壯苗生根培養(yǎng)過程中，當培養(yǎng)基中生長素濃度相對細胞分裂素而言過高時，趨向于長根，抑制莖芽的生長(處理6)，而當培養(yǎng)基中細胞分裂素相對生長素而言過高時，雖然有明顯的芽分化，但使其分化苗不能正常生長而死亡(處理7)。說明在不同的誘導培養(yǎng)階段，為了促進芽器官的分化或壯苗生根培養(yǎng)，應(yīng)適當調(diào)整培養(yǎng)基中生長素與細胞分裂素的比例。實驗篩選出白芨原球莖誘導最適培養(yǎng)基配方為:MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。白芨為生根較容易植物，各處理培養(yǎng)基都促進了白芨生根，綜合調(diào)查白芨的壯苗指標和生根情況，發(fā)現(xiàn)以培養(yǎng)基為MS+6－BA 0.45 mg/L+NAA 0.4 mg/L作用較明顯。

圖版說明:A:白芨蒴果;B:由白芨種子誘導出原球莖及芽的分化;C:白芨壯苗生根培養(yǎng);D:生根白芨無菌苗移栽到蛭石。Explanation of plates:A:Capsule of Bletilla striata as indicated by arrow;B:Protocorm induction and bud differentiation of Bletilla striata;C:Lustihood and rooting culture of Bletilla striata;D:The sterile seedlings of Bletilla striata after rooting was transplanted into the vermiculite.

瓶苗移栽實驗結(jié)果表明，白芨無菌苗最適宜的移栽生長基質(zhì)為蛭石(表4)。蛭石具有良好的保水透氣性能，這也與白芨性喜溫暖而又濕潤的環(huán)境，要求排水良好含腐殖土較多的沙壤土的特性吻合。此外，白芨瓶苗的葉較薄，出瓶后極易脫水而使葉邊緣焦枯，從而影響成活率，保證移栽前期的空氣濕度在80% ～90%，可提高移栽成活率。

本實驗主要采用的是種子萌發(fā)方法繁殖，雖然增殖系數(shù)不高，但成苗迅速且苗的質(zhì)量好。本研究中，以種子作為外植體，30 d就開始萌動，60 d小苗就分化完全，這也與韋卡婭等的研究結(jié)果相一致[11]。研究表明利用幼嫩塊莖作為外植體誘導叢生芽，60 d才有小芽形成，且分化效率不高[11]。此外，白芨塊莖長期在地下，受病菌和泥土污染嚴重，很難徹底滅菌，而且由于分化效率低、成苗所需時間長等原因，白芨塊莖、側(cè)芽等作為外植體的方法目前遠不如種子萌發(fā)方法普遍。

本研究得到白芨高效成苗的技術(shù)流程為:白芨成熟尚未開裂的蒴果消毒滅菌處理后將種子播于培養(yǎng)基MS+KT 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L進行原球莖的誘導和芽的分化，50 d后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基MS+6－BA 0.45 mg/L+NAA 0.4 mg/L進行壯苗生根培養(yǎng)30 d，而后將生根無菌苗移栽到蛭石中，移栽初期進行適當遮蔭并保持較高的空氣濕度，成活率可達到96%。

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