李 田，彭振英，范仲學(xué)，畢玉平1，*

(1.山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 高新技術(shù)研究中心/山東省作物遺傳改良與生態(tài)生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100;3.濱州學(xué)院 山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濱州256603)

轉(zhuǎn)錄因子是一類能夠特異性作用于真核基因的順式作用元件，從而對轉(zhuǎn)錄起到激活或抑制作用的一類DNA結(jié)合蛋白?；虮磉_(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在其響應(yīng)脅迫的過程中起作用的轉(zhuǎn)錄因子是植物中最重要的一類調(diào)節(jié)基因。近年來，發(fā)現(xiàn)某一轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)可以調(diào)控下游多個(gè)與之相關(guān)的功能基因的表達(dá)。因此通過利用轉(zhuǎn)錄因子來改良植物的品質(zhì)與特性，通常比轉(zhuǎn)單一功能基因的途徑具有更理想的效果。

MYB家族轉(zhuǎn)錄因子是植物中數(shù)量最多且作用十分重要的一類轉(zhuǎn)錄因子，它們以含有高度保守的MYB結(jié)構(gòu)域?yàn)樘卣?，每個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域含有50～53個(gè)氨基酸殘基，且每個(gè)MYB區(qū)域中一般都含有3個(gè)保守的色氨酸殘基，其間隔包含18或19個(gè)氨基酸。根據(jù)所含的相鄰MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)目，可將其劃分為單一MYB結(jié)構(gòu)域蛋白(single－MYB)、2個(gè)串聯(lián)MYB結(jié)構(gòu)域蛋白(R2R3－MYB)和3個(gè)串聯(lián)MYB結(jié)構(gòu)域蛋白(R1R2R3－MYB)3種類型。研究表明，MYB家族轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與細(xì)胞內(nèi)各種生命活動，在植物生長發(fā)育和應(yīng)對環(huán)境脅迫過程中發(fā)揮重要作用[1－2]。

隨著轉(zhuǎn)錄因子的研究，許多具有不同調(diào)控作用的MYB轉(zhuǎn)錄因子從植物中分離出來。在含有單個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域的MYB蛋白的研究中，以往發(fā)現(xiàn)的蛋白(擬南芥的LHY、CCAI、CPC和RTBP1，水稻的RTBP21，玉米的IBP21等)均為端粒結(jié)合蛋白，其功能主要在于維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性[3]。Dong等人在馬鈴薯中發(fā)現(xiàn)StMYB1R－1基因，是一個(gè)與植物耐逆性有關(guān)的單一MYB結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子。該基因可激活干旱誘導(dǎo)相關(guān)基因，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)水分缺失達(dá)到抗旱目的。對于MYB家族中種類最多的R2R3－MYB成員其研究相對豐富，目前發(fā)現(xiàn)的與植物耐逆相關(guān)的基因有很多。僅在擬南芥中就發(fā)現(xiàn)了許多與生物和非生物脅迫相關(guān)的基因，主要包括AtMYB2、AtMYB41、AtMYB44和AtMYB60等與抗逆相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子。其中AtMYB2基因可在干旱誘導(dǎo)條件下高效表達(dá)，AtMYB41基因只在干旱、ABA及鹽脅迫誘導(dǎo)下才能表達(dá)，正常生長條件下該基因不表達(dá)。另外，兩者通過不同的機(jī)制提高對逆境脅迫的適應(yīng)，其中AtMYB2通過調(diào)控受ABA信號誘導(dǎo)的基因表達(dá)來調(diào)節(jié)植物對環(huán)境變化的反應(yīng);AtMYB41則通過參與調(diào)控植物細(xì)胞的形態(tài)變化，主要是調(diào)控表皮發(fā)育及細(xì)胞增殖來增強(qiáng)植物對逆境的適應(yīng)力[5－7]。At-MYB44是一類依賴于ABA信號誘導(dǎo)的參與植物非生物脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)基因植株通過調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉達(dá)到提高耐逆性的目的[8]。AtMYB60基因被證實(shí)參與植物的耐旱脅迫過程，其通過脫落酸信號級聯(lián)反應(yīng)來調(diào)節(jié)植物氣孔運(yùn)動、干旱脅迫及抗病性[9]。

絨毛白蠟(Fraxinus velutina Torr.)屬于木犀科白蠟樹屬，其耐鹽性強(qiáng)，分布范圍廣，是優(yōu)良的鹽堿地造林綠化和城市園林綠化樹種，也是我國北方沿海地區(qū)最常用的耐鹽樹種[10]。挖掘白蠟中的關(guān)鍵耐鹽基因，揭示白蠟?zāi)望}的分子機(jī)制及其所涉及的主要代謝途徑，可為植物耐鹽特性的遺傳改良提供新的基因資源。然而，目前有關(guān)從林木中分離與耐逆相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究還很少。

本研究對從絨毛白蠟中克隆到的兩個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子新基因FvMYB1和FvMYB2的轉(zhuǎn)錄激活活性進(jìn)行了分析;并初步分析了兩個(gè)基因在不同組織中的表達(dá)模式，為進(jìn)一步明確FvMYB1和FvMYB2植物代謝調(diào)控途徑中對下游靶基因的調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 植物材料與總RNA提取

供試絨毛白蠟(Fraxinus velutina Torr.)品種由山東省林業(yè)科學(xué)院提供。白蠟種子播種后于溫室中培養(yǎng)28 d后開始取材，分別剪取根、子葉、莖和葉，液氮凍存?zhèn)溆?。采用改良CTAB法提取白蠟各組織總RNA，提取后采用DNase I(TaKaRa，大連)去除DNA。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用各種限制性內(nèi)切酶及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自Fermentas公司;所用引物均由上海生工合成;pEASY－T3載體購自北京全式金公司;酵母缺陷型培養(yǎng)基購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司;pGBKT7載體及酵母菌株AH109均由本實(shí)驗(yàn)室保存。其它主要常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 酵母表達(dá)效應(yīng)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

采用引物YM1F和YM1R，YM2F和YM2R以包含目的基因的質(zhì)粒為模板，分別擴(kuò)增出FvMYB1和FvMYB2基因的完整開放閱讀框。引物名稱及序列如表1所示。擴(kuò)增產(chǎn)物和pGBKT7載體經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、回收后，T4連接酶將擴(kuò)增片段分別連于pGBKT7酵母表達(dá)載體上。PCR篩選陽性克隆后進(jìn)一步送測序，測序驗(yàn)證目的基因與BD(DNA－binding domain)融合表達(dá)的讀碼框正確后，采用LiCl法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌感受態(tài)細(xì)胞AH109進(jìn)行酵母表達(dá)。

1.4 β–半乳糖苷酶活性濾紙顯色反應(yīng)

隨機(jī)挑取酵母菌單克隆，分別劃線于SD/－Trp和SD/－Trp/－His/－Ade單缺和三缺營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)2～3 d，觀察酵母菌的生長情況。取一張滅菌過的濾紙，將酵母菌影印到濾紙上，將帶有酵母克隆的濾紙?jiān)谝旱蟹磸?fù)凍融3～4次，每次10 min。將pH 7.4的 PBS 緩沖液(NaCl 8 g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO41.42 g/L，KH2PO40.27 g/L)加入X－gal使其終濃度為0.1 mg/mL，混勻后倒在濾紙(菌落面朝上)上;凝固后于室溫下觀察，其中顯藍(lán)色的菌落其β－半乳糖苷酶活性為陽性，未顯色的為假陽性。由于相互作用強(qiáng)弱不同，出現(xiàn)藍(lán)色的時(shí)間不等(幾分鐘到數(shù)小時(shí));最后拍照記錄。

表1 引物Tab.1 Primers

1.5 β–半乳糖苷酶活性檢測法定量分析重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性

從選擇性培養(yǎng)基平板上挑取酵母轉(zhuǎn)化子菌落接種于5 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min過夜培養(yǎng)。取上述2 mL菌液接種于8 mL YPDA培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至細(xì)胞對數(shù)生長期(OD600=0.5～0.8)，記錄OD600值。將1.5 mL菌液離心棄上清，加入等體積pH 7.0的 Z － Buffer(Na2HPO4·7H2O 16.1 g/L，NaH2PO4·H2O 5.50 g/L，KCL 0.75 g/L，MgSO4·7 H2O 0.246 g/L)重懸;離心后再重懸于300 μL Z－Buffer。取上述濃縮菌液100 μL，液氮中冷凍1 min后置于37℃水浴1 min;反復(fù)凍融2次，使細(xì)胞充分裂解，同時(shí)以Z－Buffer作為對照;在上述管中每個(gè)加入300 μL Z－Buffle/β－巰基乙醇，然后再加入160 μL新鮮配制的ONPG(4 mg/mL)，37℃水浴并立即開始計(jì)時(shí);當(dāng)菌液呈現(xiàn)黃色時(shí)，立即加入400 μL 1 mol/L的Na2CO3，并記錄反應(yīng)時(shí)間;12 000 r/min離心15 min后吸取上清至比色杯中，測定OD420值。每個(gè)樣品重復(fù)3次。采用如下公式計(jì)算酶活:β–半乳糖苷酶活性單位=1 000×OD420/(T×V×OD600)，其中T=反應(yīng)時(shí)間(min)，V=0.1×濃縮因子，本實(shí)驗(yàn)中濃縮因子為 1.5 mL/300 μL=5。

1.6 cDNA合成與半定量RT－PCR分析

cDNA第一鏈合成采用AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，加拿大)，20 μL反應(yīng)體系包括:總 RNA 1 μg，Oligo(dT)18 primer 1 μL，5 × Reaction Buffer 4 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL，RiboLocK RNase Inhibitor(20 U/μL)1 μL，RevertAid M － MuLV Reverse Transcriptase(200 U/μL)1 μL，DEPC · H2O 11 μL。反轉(zhuǎn)錄cDNA于－20℃保存。

根據(jù)所獲得cDNA序列設(shè)計(jì)半定量RT－PCR引物。FvMYB1半定量RT－PCR正向引物為RTM1F，反向引物為RT－M1R;FvMYB2半定量RT－PCR正向引物為RT－M2F，反向引物為RT－M2R;具體序列見表1。同時(shí)，根據(jù)文獻(xiàn)[11]設(shè)計(jì)白蠟的actin引物，作為調(diào)整模板量的內(nèi)參。引物均由上海生物工程公司合成。

20 μL的半定量 RT－PCR的反應(yīng)體系為:經(jīng)內(nèi)參調(diào)整的適宜體積的 cDNA模板，正向引物(10 mmol/μL)1 μL，反向引物(10 mmol/μL)1 μL，dNTP Mix 10 μL，ddH2O 補(bǔ)齊至 20 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性3 min;接著95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，25個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖1 重組質(zhì)粒pGBKT7－FvMYB1和pGBKT7－FvMYB2的構(gòu)建Fig.1 Construction of the recombinant plasmids pGBKT7－FvMYB1 and pGBKT7－FvMYB2

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母表達(dá)效應(yīng)質(zhì)粒的構(gòu)建

分別在目的基因的讀碼框上游及下游設(shè)計(jì)引物，并在兩端加上EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)，從含有目的基因全長的pEASY－T3克隆載體中擴(kuò)增FvMYB1和FvMYB2的開放閱讀框，將目的基因克隆到酵母表達(dá)載體pGBKT7上，構(gòu)建融合表達(dá)載體pGBKT7－FvMYB1;同理構(gòu)建FvMYB2的酵母融合表達(dá)載體pGBKT7－FvMYB2。重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖1所示，構(gòu)建好的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后(圖2)可用于后續(xù)研究。

2.2 酵母單雜交驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄激活功能

將不含目的基因的質(zhì)粒pGBKT7和構(gòu)建好的pGBKT7－FvMYB1、pGBKT7－FvMYB2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109中，在單缺和3缺培養(yǎng)基上篩選相應(yīng)質(zhì)粒的酵母菌轉(zhuǎn)化子。其中，陰性對照pGBKT7的酵母轉(zhuǎn)化子只在SD/–Trp平板上生長，不能在缺少SD/–Trp/–His/–Ade的3缺培養(yǎng)基上生長，而含有 pGBKT7－FvMYB1和 pGBKT7－FvMYB2質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化子在兩種培養(yǎng)基上均能正常生長。濾紙顯色反應(yīng)表明2個(gè)載體均能顯現(xiàn)明顯的藍(lán)色，而陰性對照則未顯現(xiàn)藍(lán)色，說明它們都具有轉(zhuǎn)錄激活功能，并激活了下游His和LacZ基因的表達(dá)(圖3)。β–半乳糖甘酶活性檢測結(jié)果進(jìn)一步顯示，雖然兩者都有轉(zhuǎn)錄活性，但存在一定的強(qiáng)弱差異，pGBKT7－FvMYB1的半乳糖苷酶活性為14.55 U，而 pGBKT7－FvMYB2的半乳糖苷酶活性為20.80 U(表2)。

圖2 重組質(zhì)粒pGBKT7－FvMYB1和pGBKT7－FvMYB2的雙酶切鑒定Fig.2 Restriction enzyme digestion of the recombinant plasmids pGBKT7－FvMYB1 and pGBKT7－FvMYB2

表2 FvMYB1和FvMYB2蛋白在酵母中的β–半乳糖苷酶活性檢測Tab.2 β－Galaetosidase activity assay of FvMYB1 and FvMYB2 Proteins in yeast

圖3 FvMYB1和FvMYB2在酵母系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)錄激活功能分析Fig.3 Transcriptional activation assay of the FvMYB1and FvMYB2 proteins by yeast expression system

2.3 組織特異性表達(dá)分析

分別提取白蠟幼苗的根、子葉、莖和葉的總RNA，利用半定量RT－PCR方法對FvMYB1和FvMYB2的組織特異性進(jìn)行分析。半定量結(jié)果顯示，兩個(gè)基因在上述被檢測組織中均有表達(dá)，但兩者的表達(dá)情況存在差異。其中FvMYB1基因在莖中的表達(dá)量最高，其次是子葉和葉中的表達(dá)量，且子葉和葉兩者間的表達(dá)量差異不明顯，而根中表達(dá)量最低。FvMYB2基因在各組織中均有表達(dá)，且各組織間的表達(dá)量未見明顯差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，在相同模板量及擴(kuò)增條件下，F(xiàn)vMYB2基因表達(dá)量較FvMYB1的表達(dá)量要低(圖4)。

3 討論

圖4 FvMYB1和FvMYB2在不同組織中表達(dá)的RT－PCR分析Fig.4 Expression analysis of FvMYB1 and FvMYB2 in different tissues by RT－PCR

酵母單雜交系統(tǒng)可用來研究轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，其原理在于真核生物的轉(zhuǎn)錄因子通常由一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)和一個(gè)或多個(gè)其他調(diào)控蛋白相互作用的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)組成。用于酵母單雜交系統(tǒng)的GAL4，其DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域可單獨(dú)作用。因此，可將待研究的轉(zhuǎn)錄因子與酵母GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合，如果其表達(dá)的蛋白能與目的基因作用，就可激活下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，從而推測此轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活活性[12－13]。自酵母單雜交技術(shù)誕生以來，其在驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性方面得到了廣泛應(yīng)用。早期Mak等[14]利用此技術(shù)發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中存在螺旋－環(huán)－螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，并證實(shí)其具有轉(zhuǎn)錄活性。Nishiyama等[15]將該技術(shù)與點(diǎn)突變方法結(jié)合后用于對轉(zhuǎn)錄活性片段Elf－1的分析，不僅證明其轉(zhuǎn)錄活性并指出其具激活作用的區(qū)域位于第87－175堿基。近年來，許多轉(zhuǎn)錄因子，如NAC類、AP2轉(zhuǎn)錄因子和DREB類轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活活性都通過這一技術(shù)得到了驗(yàn)證[16－18]。然而并不是所有的轉(zhuǎn)錄因子都具有轉(zhuǎn)錄激活活性，Zhao等[18]分離到的Group I和Group II兩類DREB轉(zhuǎn)錄因子，其中后者就不具有激活活性。大多數(shù)MYB轉(zhuǎn)錄因子具有轉(zhuǎn)錄激活功能，具有轉(zhuǎn)錄激活功能是轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)重要特征，也是對下游相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄調(diào)控的保證[19]。本研究通過酵母單雜交實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了FvMYB1和FvMYB2在酵母中能夠激活報(bào)告基因(His3、LacZ)的表達(dá)，表明這兩個(gè)基因和其他植物中已克隆的MYB類轉(zhuǎn)錄因子具有相似的轉(zhuǎn)錄激活功能。β－半乳糖甘酶活性檢測結(jié)果進(jìn)一步顯示，兩者的轉(zhuǎn)錄活性存在一定的強(qiáng)弱差異，其中效應(yīng)質(zhì)粒pGBKT7－FvMYB2的激活活性約是 pGBKT7－FvMYB1活性的1.5倍，由此推斷效應(yīng)質(zhì)粒 pGBKT7－FvMYB2的激活活性較pGBKT7－FvMYB1的活性高。而關(guān)于FvMYB2是否同樣在植物中較FvMYB1能夠表現(xiàn)出更高的耐逆抗性還需要通過構(gòu)建植物表達(dá)載體予以進(jìn)一步驗(yàn)證。

研究發(fā)現(xiàn)，不同植物中的MYB家族基因具有各異的時(shí)空表達(dá)模式。對于從植物中分離到的MYB基因，其中多數(shù)為組成型表達(dá)，即在植物的各種器官(營養(yǎng)器官、繁殖器官)中均有表達(dá)，如擬南芥的At-MYB33和AtMYB65等[20]。Zhang等[21]通過半定量RT–PCR方法對小麥中的數(shù)十個(gè)MYB基因在根、莖、葉、雌蕊和雄蕊的組織表達(dá)模式進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)了小麥MYB基因中的60種特定的組織表達(dá)模式。其中一半的小麥MYB基因在所有測試組織中均有高水平表達(dá)，這些基因的組成型表達(dá)表明它們在生理和發(fā)育過程的各個(gè)方面發(fā)揮著作用。本研究通過半定量RT－PCR表明FvMYB1和FvMYB2基因在被測的各組織中也均有表達(dá)。但各自組織表達(dá)模式又呈現(xiàn)出一定的差異，其中FvMYB1基因表達(dá)量在莖中最高，而在根中最低;FvMYB2則在白蠟各組織中未表現(xiàn)出差異，但從表達(dá)強(qiáng)度上看，要略低于FvMYB1基因的表達(dá)。此外，植物中還存在大量的具有組織表達(dá)特異性的MYB基因。如玉米中控制花青素合成的C1和Pl基因，其中C1只在糊粉層和花中特異表達(dá)，而Pl卻只在葉等營養(yǎng)組織中花青素的表達(dá)[22]。牽牛的An2基因則只在花冠和花粉管中表達(dá)，而花藥中卻不表達(dá)此基因[23]。Ban等[24]發(fā)現(xiàn)MdMYBA基因只存在于蘋果(Malus×domestica)果皮中，該基因表達(dá)具有明顯的組織和品種特性，與調(diào)控果皮顏色具有十分密切的關(guān)系?；虻奶禺愋员磉_(dá)有其重要的生理意義，這是因?yàn)樵S多重要的基因在特定組織中選擇性表達(dá)通常涉及植物自身的一些特殊生理和發(fā)育過程。植物正是通過上述基因組織表達(dá)模式來調(diào)控正常的生命活動以及適應(yīng)不斷變化的外部環(huán)境。

植物的抗逆性狀是多基因控制的復(fù)雜性狀，遺傳調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜。上述研究表明所獲得兩個(gè)基因具有轉(zhuǎn)錄激活活性，具備典型轉(zhuǎn)錄因子的特征。但對于FvMYB1和FvMYB2基因的功能分析還需要借助轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行進(jìn)一步的研究。因此，后續(xù)工作將繼續(xù)研究不同脅迫條件下基因的表達(dá)模式變化，以及通過構(gòu)建兩者的過量表達(dá)載體及RNAi干擾載體，進(jìn)行白蠟的遺傳轉(zhuǎn)化，從而對基因的功能進(jìn)行更充分的鑒定。

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