張紅梅 王明艷 韓秀玲 吳 鵬 龍月紅 邢朝斌

(河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，②文法學(xué)院 河北唐山 063000;①中國人民大學(xué)附屬中學(xué)朝陽學(xué)校)

刺五加(Eleutherococcus senticosus Harms)是我國醫(yī)藥珍品，根、莖、葉均可入藥。自70年代末以來以刺五加為原料生產(chǎn)的各種片劑、沖劑、針劑和刺五加參茶等產(chǎn)品遠銷國外，因而使刺五加資源消耗與日俱增[1，2]。經(jīng)過幾十年掠奪式的采挖，嚴重地破壞了野生刺五加資源;在自然狀態(tài)下刺五加有性繁殖能力差[3]，無性繁殖困難[2]，1992 年出版的《中國植物紅皮書》已把刺五加列為了漸危物種。

利用超薄切片進行透射電鏡觀察，能獲得分辨率高、內(nèi)容豐富的植物細胞信息，使其成為植物細胞結(jié)構(gòu)研究的重要工具。但植物的細胞壁厚、結(jié)構(gòu)密集、藥物滲透較慢，加之操作步驟繁瑣，致使制備難度加大[4]。因此，鮮見藥用植物的相關(guān)報道。本文采用透射電鏡觀察刺五加葉的細胞結(jié)構(gòu)特征，為深入研究細胞的組織結(jié)構(gòu)和藥材的鑒別提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 以吉林省伊通滿族自治縣3年生野生刺五加的葉片為供試材料，并經(jīng)作者鑒定。

1.2 方法 ①取材:取無病蟲危害、無其它污染的刺五加葉片，用清水洗凈后剪成0.5cm×1cm大小，作為樣品;②戊二醛固定:將樣品立即放入2.5%戊二醛固定液中，使葉片充分浸沒，固定時間24h;③沖洗:吸除固定液，用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.2)沖洗3次，每次15min;④鋨酸固定:去除磷酸緩沖液，浸入在1%鋨酸中固定1h后，重蒸水洗滌3次，每次15min;⑤脫水:經(jīng)體積分數(shù)為30%、50%、70%(過夜)、90%、100%的乙醇逐級脫水，每次15min。去除乙醇，加入100%乙醇:100%丙酮(1:1)、100%丙酮處理，每次15min。樣品在70%乙醇脫水之前，實驗均是在0～4℃下進行，樣品進入90%乙醇脫水時在室溫下進行。⑥包埋:用環(huán)氧丙烷:包埋劑(1:1)滲透45min后，用812樹脂包埋劑進行包埋，分別在37℃中聚合12h，60℃中聚合24h，即可取出待用。⑦切片與染色:將上述樣品進行修樣切片，最后經(jīng)乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染10min;⑧觀察:在日立H－7650透射電子顯微鏡下觀察、照相。

2 結(jié)果

幼嫩葉片葉肉細胞排列緊密、整齊，細胞核較大，居于細胞中央。相鄰細胞間有胞間連絲相連，見圖1。細胞質(zhì)中含有葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體及淀粉粒等細胞器，液泡小，見圖 1、2。

圖1 細胞間的胞間連絲(×15000)

圖2 葉肉細胞中的細胞器(×20000)

葉片成熟后細胞體積變大，核較小，且被液泡擠壓到細胞的邊角處，各種細胞器數(shù)量變少，僅有葉綠體和淀粉粒等被擠壓到細胞邊緣，每個葉肉細胞中約有葉綠體5～10個，沿細胞周圍分布，呈橢圓狀，見圖3。

圖3 葉肉細胞中的葉綠體(×2000)

圖4 葉綠體解體過程(×25 000)

透射電鏡下的葉綠體均呈卵圓形，或橢圓形，平均長軸長為:7.72μm，短軸長為:3.91μm，基粒片層排列整齊緊密、結(jié)構(gòu)清晰，部分輕微膨脹，基粒片層有8～20層，與基質(zhì)片層界限清晰，葉綠體中散布有體積較小的淀粉粒;葉肉細胞中的部分葉綠體膜內(nèi)陷，膜上具小孔，少量葉綠體膜破裂，葉綠體解體(圖4箭頭所示)。葉肉細胞的中央有1個大液泡，液泡體積大，約占成熟細胞總體積的4/5，液泡膜完整，充實，與外圍存在的細胞質(zhì)緊密相連，見圖4。液泡中有絮狀物和體積大的囊泡，把液泡劃成幾部分，其內(nèi)還發(fā)現(xiàn)有多層膜繞成的不定形團，見圖5。葉肉細胞中線粒體結(jié)構(gòu)完整，多呈較規(guī)則的圓球形或橢圓形，雙層膜、內(nèi)嵴清晰可見，呈隨機排列。細胞核多為圓球形或不規(guī)則形，雙層膜、核孔結(jié)構(gòu)清晰、完整，內(nèi)部染色質(zhì)均勻分布，見圖1、2。

圖5 適應(yīng)生長環(huán)境形成的液泡(×30 000)

字母縮寫說明:

CW(cell wall):細胞壁;P(plasmodesma):胞間連絲;M(mitochondrion):線粒體;CH(chloroplast):葉綠體;ST(stroma thylakoid):基質(zhì)類囊體;GT(granum thylakoid):基粒類囊體;SG(starch grin):淀粉粒;N(nucleus):細胞核;NM(nucleus membrane):核膜;NH(nuclear hole):核孔;ER(endoplasmic reticulum):內(nèi)質(zhì)網(wǎng);G(golgi complex):高爾基體;V(vacuole):液泡

3 討論

一般情況下，植物樣品用鋨酸進行固定時，時間延長可提高固定效果，但植物的種類較多，性能區(qū)別較大，在固定時須區(qū)別對待，對于迅速發(fā)黑的植物樣品，用鋨酸固定時不宜超過2 h，否則會造成樣品發(fā)脆，難以操作，甚至破壞掉已保存的結(jié)構(gòu)[4]。刺五加葉肉組織中具有較大的液泡，在溶液中葉片難以下沉，是較難固定的植物透射電鏡樣品。加之，細胞壁結(jié)構(gòu)堅硬，藥物難以滲透，其樣品制備更加困難。若采用常規(guī)制備方法，則會出現(xiàn)葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)不清晰、切片有顛痕和開裂等不良現(xiàn)象，不能進行大視野的結(jié)構(gòu)觀察和攝影。筆者采用鋨酸固定1h，減少樹脂滲透濃度的方法制備出的刺五加葉片樣品，整體信息豐富，結(jié)構(gòu)保存良好，沒有出現(xiàn)不良現(xiàn)象。812樹脂是制備植物樣品的良好材料，但一旦受潮發(fā)軟，切片上會出現(xiàn)褶皺，影響觀察。因此，要在干燥的環(huán)境中進行樹脂的相關(guān)操作。

透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，部分葉片樣品中，液泡膜出現(xiàn)內(nèi)陷，形成細胞質(zhì)突起和細胞質(zhì)帶，有時形成多層的膜狀結(jié)構(gòu)，見圖5。我們認為這是刺五加長期生長于寒冷氣候條件下，為防止細胞結(jié)冰形成的與環(huán)境相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)，是對環(huán)境高度適應(yīng)性的反應(yīng)。因為液泡膜內(nèi)陷的同時，大量細胞質(zhì)，乃至某些細胞器也常常被吞噬到液泡中，膜層結(jié)構(gòu)和吞噬物經(jīng)液泡中多種酶的溶解，提高了液泡中溶質(zhì)濃度，由于液泡中溶質(zhì)濃度的提高，降低了液泡中的水分向細胞質(zhì)滲透的速度，避免了溶質(zhì)濃度過度稀釋而引起結(jié)冰，同時也減少了細胞單位體積內(nèi)結(jié)冰的水含量[5]。

[1] 祝 寧，卓麗環(huán)，臧潤國.刺五加(Eleutherococcus sentincosus)會成為瀕危種嗎? [J].生物多樣性，1998，6(4):253

[2] 邢朝斌，沈海龍，趙麗娜，等.刺五加的體細胞胚胎發(fā)生研究[J].中草藥，2006，25(5):769

[3] 邢朝斌，沈海龍，黃 劍，等.不同溫度、時間層積處理對刺五加種子發(fā)芽的影響[J].遼寧林業(yè)科技，2006，9(5):9

[4] 徐柏森，張耀麗，何開躍，等.植物透射電鏡樣品制備技術(shù)探討[J].中國野生植物資源，2006，25(3):41

[5] 李 琪，王 雙.沙冬青葉肉細胞中液泡膜內(nèi)陷特征的電鏡觀察[J].電子顯微學(xué)報，1993，12(1):101