杜利君，蔣興亮

(1.南充市中心醫(yī)院，川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院;2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川南充 637000)

體外建立人血管內(nèi)皮細(xì)胞模型是研究人體大血管內(nèi)皮功能的主要手段之一。由于內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304在形態(tài)學(xué)、基因?qū)W等生物特性上與內(nèi)皮細(xì)胞比較存在明顯差異［1］，因此，體外分離和原代培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)已成為國內(nèi)外學(xué)者獲取內(nèi)皮細(xì)胞的重要途徑。本實(shí)驗(yàn)在借鑒其他學(xué)者體外分離、培養(yǎng)HUVECs技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過大量的實(shí)驗(yàn)并對此加以改良，旨在建立一種操作簡便、且能夠獲得數(shù)量較多及活力良好的HUVECs的分離、培養(yǎng)方法，為進(jìn)一步研究血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能及闡明相關(guān)疾病的生理和病理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

M199培養(yǎng)液和胎牛血清分別為Invitrogen公司和Hyclone公司產(chǎn)品，IV型膠原酶、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(ECGS)、肝素鈉均為Sigma公司產(chǎn)品，胰蛋白酶為Amresco公司產(chǎn)品，PBS、兔抗人Ⅷ因子抗體及FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體為北京中杉金橋公司產(chǎn)品，青霉素和鏈霉素為華北制藥股份有限公司產(chǎn)品。25 cm2培養(yǎng)瓶和15 mL無菌離心管為Corning公司產(chǎn)品，0.22 μm一次性過濾器為Millipore產(chǎn)品。二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺為Heal Force公司生產(chǎn)，倒置熒光顯微鏡為Olympus公司生產(chǎn)。

1.2 臍帶來源

收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院剖腹產(chǎn)新生兒臍帶。選擇無HBV和HIV感染、無妊娠期高血壓的健康孕婦，剖腹產(chǎn)手術(shù)后無菌獲取15～20 cm新生兒臍帶，保存于4℃ PBS液中，2 h內(nèi)分離HUVECs。

1.3 方法

1.3.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離 無菌條件下取長度為15～20 cm的新生兒臍帶，立即于超凈工作臺內(nèi)剪去臍帶兩端的鉗痕、血腫并修齊斷面，找到管壁較薄、管腔略大的臍靜脈。將7號靜脈輸液針、連帶針鞘一并輕輕插入臍靜脈內(nèi)，用止血鉗固定輸液針，輸液針的另一端連接20 mL注射器，吸取37℃預(yù)熱的PBS沖洗臍靜脈至流出的液體無色透明。抽取37℃預(yù)熱的0.1%IV型膠原酶溶液將臍靜脈內(nèi)剩余的PBS沖出，待下端流出黃色膠原酶溶液時用止血鉗夾閉血管，繼續(xù)注入膠原酶溶液至臍靜脈充盈飽滿，37℃消化10 min。將臍帶用無菌紗布包裹，輕輕揉搓1～2 min，促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞從管壁脫落。將消化液收集于離心管內(nèi)，用含20%FBS的培養(yǎng)液沖洗臍靜脈，將其一并收集于離心管內(nèi)，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入37℃預(yù)熱的M199完全培養(yǎng)基(含20%胎牛血清、25 μg/mL內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、0.25 mg/mL肝素、100 U/mL青霉素和 100 U/mL鏈霉素)，吹打混勻，制成 1×106/mL的細(xì)胞懸液，將其接種至25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)液，以后每隔2～3 d換液，直至細(xì)胞長至80%融合狀態(tài)。

1.3.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞長至80%融合狀態(tài)時，在無菌操作下吸棄舊培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞2次。加入0.25%胰蛋白酶溶液，倒置顯微鏡見大部分細(xì)胞開始回縮變圓時，迅速吸棄胰蛋白酶溶液，加入5 mL M199完全培養(yǎng)基中止消化。反復(fù)吹打瓶底貼壁細(xì)胞使之脫落，加入足量的M199完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，按1∶3的比例將其接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)液，以后每隔2～3 d換液，直至細(xì)胞生長至80%融合狀態(tài)。

1.3.3 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定 ①人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的接種:取生長至80%融合狀態(tài)的第1～2代細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶溶液常規(guī)消化，將密度為5×105/mL的細(xì)胞懸液接種至六孔板內(nèi)的無菌蓋玻片上，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。②形態(tài)學(xué)鑒定:每隔24 h，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)特點(diǎn)。③免疫熒光鑒定(以下操作均是先吸棄上清，再加入100 μL作用液)。

當(dāng)細(xì)胞生長至80%融合狀態(tài)時，用37℃預(yù)熱的PBS洗滌細(xì)胞3次。預(yù)冷的4%多聚甲醛固定10 min，PBS蕩洗3次，每次5 min。10%封閉正常羊血清室溫封閉30 min，加入兔抗人Ⅷ因子抗體(稀釋度1∶100)，對照組以 PBS代替Ⅷ因子抗體，置于4℃濕盒內(nèi)孵育過夜(10 h)。PBS洗滌4次，每次5 min。加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(稀釋度1∶100)，37℃濕盒內(nèi)避光作用30 min。PBS洗滌4次，每次10 min。熒光倒置顯微鏡下觀察并采集圖片。

2 結(jié)果

2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

原代分離的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞單個或聚集成團(tuán)，2 h后大部分細(xì)胞開始貼壁生長。貼壁后，單個細(xì)胞呈多角形或長梭形生長，成團(tuán)的細(xì)胞逐漸伸展為中心排列密集、邊緣排列較疏松的單層細(xì)胞集落，呈魚貫狀相連或旋窩狀排列，周邊細(xì)胞多為長梭形并游離向外生長。傳代培養(yǎng)細(xì)胞生長較快，接種后0.5～1 h大部分細(xì)胞開始貼壁，呈單個、圓形并散在均勻分布;12～24 h多數(shù)細(xì)胞呈小多角形或圓形，少數(shù)細(xì)胞形態(tài)伸展，呈短梭形，單個或團(tuán)簇存在;24～72 h細(xì)胞生長加快，胞核清晰，胞漿豐富，內(nèi)含小顆粒，細(xì)胞呈長梭形或橢圓形生長，逐漸融合成片，呈扁平多角形相互嵌合，如典型的鋪路石狀鑲嵌 排列(圖1)。

2.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的免疫熒光鑒定

加入Ⅷ因子抗體的細(xì)胞輪廓清晰，99%以上細(xì)胞的胞漿內(nèi)有綠色熒光顆粒，胞核呈黑色無熒光著染;而陰性對照孔中僅見模糊的細(xì)胞輪廓，無熒光著染(圖2)。提示分離得到的細(xì)胞有Ⅷ因子相關(guān)抗原存在，鑒定為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞是血管壁的重要組成部分，具有重要的屏障功能。內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能受損是動脈粥樣硬化發(fā)生的始動因素，在心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［2］。本研究選擇人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為獲取血管內(nèi)皮細(xì)胞的來源，是因?yàn)镠UVECs具有以下優(yōu)點(diǎn):①與來源于其它哺乳動物(牛、兔、鼠)的血管內(nèi)皮細(xì)胞相比，HUVECs可使實(shí)驗(yàn)條件和所獲結(jié)果更符合人體情況。②相對于人體其它血管來說，臍靜脈流動的是含氧豐富的動脈血，HUVECs結(jié)構(gòu)和功能接近于動脈內(nèi)皮細(xì)胞。此外，新生兒臍帶來源豐富，取材方便，且能獲得較多數(shù)量的內(nèi)皮細(xì)胞，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。③原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞株的比較。內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304 已被證實(shí)為膀胱癌上皮細(xì)胞［3］，Brown 等［1］研究顯示，與原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞比較，ECV304在形態(tài)學(xué)、基因?qū)W等生物特性上存在明顯差異。此外，路靜等［4］研究發(fā)現(xiàn)與原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞相比，HUVECs細(xì)胞株部分抗原減弱或丟失，可能與其傳代次數(shù)過多有關(guān)。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離及原代培養(yǎng)的影響因素較多，其中忽略任何一個環(huán)節(jié)都可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。我們在借鑒其他國內(nèi)外學(xué)者采用酶灌注消化法［5］分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞技術(shù)的基礎(chǔ)上，經(jīng)過多次摸索，主要有以下體會。①無菌培養(yǎng):嚴(yán)格的無菌觀念、無菌操作是保證細(xì)胞體外生存的首要條件。②新鮮臍帶:臍帶離體2 h內(nèi)完成臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離，此時細(xì)胞成活率最高。③膠原酶和消化時間:多數(shù)文獻(xiàn)選擇8～15 min作為膠原酶消化時間［6］，但本研究通過多次摸索認(rèn)為膠原酶的活力不僅與消化時間有關(guān)，還與酶的生產(chǎn)批號、消化溫度以及是否新鮮配置等因素相關(guān)。根據(jù)以上影響膠原酶活力的因素，嚴(yán)格掌握消化時間是成功分離內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)鍵。④灌注揉搓法分離HUVECs:有研究［7］認(rèn)為，“灌注搓揉法”能獲得較多數(shù)量的HUVECs，但我們通過多次摸索認(rèn)為，如果消化酶的活力較強(qiáng)則不宜用灌注揉搓法，否則易有靜脈壁中層的細(xì)胞消化參雜。而且，此過程中揉搓的力度必須輕柔，需要反復(fù)摸索控制揉搓力度。⑤HUVECs生長營養(yǎng)條件:HUVECs是一種增殖能力相對較低的細(xì)胞，對營養(yǎng)成分要求較高。優(yōu)質(zhì)胎牛血清和優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)液必不可少，此外，添加生長因子和肝素亦能明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖［8］。⑥培養(yǎng)基pH值:培養(yǎng)基pH值是影響細(xì)胞生長的重要因素之一。M199培養(yǎng)基可加入能較長時間控制恒定pH值范圍的10 mmol/L HEPES緩沖液，使培養(yǎng)液pH值為7.0左右，這樣易于細(xì)胞貼壁生長。此外，4℃保存的培養(yǎng)基在使用前將其置于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃預(yù)熱以調(diào)整培養(yǎng)基的pH，有利于細(xì)胞生長。⑦HUVECs接種密度:原代分離HUVECs接種密度約為1×106個/mL，傳代細(xì)胞以(1～4)×105個/mL的密度接種，細(xì)胞分布均勻，生長狀態(tài)良好。⑧HUVECs實(shí)驗(yàn)代數(shù):采用3～5代的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，隨著傳代次數(shù)增加，5代以上的細(xì)胞增殖減慢，且細(xì)胞胞漿逐漸減少，細(xì)胞變得較為扁平，呈煎雞蛋狀，與3～5細(xì)胞的形態(tài)有較大差別。

關(guān)于內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定，我們在相差倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)分離得到的細(xì)胞呈梭形或橢圓形生長，單層鋪路石狀排列或呈漩渦狀排列，具有HUVECs典型的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。此外，我們還通過最為可靠的免疫熒光抗體法證明胞漿內(nèi)有Ⅷ因子相關(guān)抗原存在。因?yàn)槿梭w的Ⅷ因子相關(guān)抗原僅在內(nèi)皮細(xì)胞、血小板和巨噬細(xì)胞中存在，所以可與血管平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞鑒別。通過免疫熒光技術(shù)檢測，在熒光顯微鏡下觀察，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的胞漿內(nèi)有大量綠色熒光顆粒，提示分離得到的細(xì)胞有Ⅷ因子相關(guān)抗原存在，以及結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察鑒定為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。

通過對30余例人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離和傳代培養(yǎng)，我們認(rèn)為采用酶消化法分離、培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的方法簡單、可靠。此方法不僅能夠獲得足夠數(shù)量和高純度的血管內(nèi)皮細(xì)胞，并且細(xì)胞活力高，增殖能力強(qiáng)，是體外研究血管內(nèi)皮細(xì)胞的理想方法，對進(jìn)一步研究血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性及其與各種疾病的關(guān)系有重要意義。

［1］ Brown J，Reading SJ，Jones S，et al.Critical evaluation of ECV304 as a human endothelial cell model defined by genetic analysis and functional responses:a comparison with the human bladder cancer derived epithelial cell line T24/83［J］.Lab Invest，2000，80(1):37-45

［2］ Victor VM，Rocha M，Solá E，et al.Oxidative stress，endothelial dysfunction and atherosclerosis［J］.Curr Pharm Des，2009，15(26):2988-3002

［3］ Dirks WG，MacLeod RA，Drexler HG.ECV304(endothelial)is really T24(bladder carcinoma):cell line cross-contamination at source［J］.In Vitro Cell Dev Biol Anim，1999，35(10):558-559

［4］ 路 靜，白睿華，楊洪艷，等.原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株的生物學(xué)特性比較［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2008，29(20):1888-1891

［5］ Baudin B，Bruneel A，Bosselut N，et al.A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells［J］.Nat Protoc，2007，2(3):481-485

［6］ 吳金義，張 蕾，張秀英，等.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定技術(shù)［J］.中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010，14(4):511-513

［7］ 呂艷欣，金 松，王 琳，等.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)［J］.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，30(8):918-919

［8］ Hewett PW.Vascular endothelial cells from human micro and macrovessels:isolation，characterisation and culture［J］.Methods Mol Biol，2009，467:95-111