王夢芝 王 曙 王 龍 王洪榮

（揚州大學動物科學與技術學院，揚州225009）

瘤胃微生物蛋白質是反芻動物重要的代謝蛋白質源，占反芻動物小腸食糜氨基酸的30%～100%［1］，并可提供足以維持正常生長和生產(chǎn)（如一定產(chǎn)奶量）的蛋白質，而且十二指腸食糜的氨基酸組成往往與瘤胃微生物蛋白質的氨基酸組成近似［2］。因此，研究瘤胃微生物蛋白質的合成規(guī)律對反芻動物生產(chǎn)有著重要的意義。瘤胃微生物蛋白質的產(chǎn)量受多種因素的調控［3］，研究較多的有飼糧結構、物理有效纖維水平、陰陽離子平衡等因素。理論上，微生物細胞分裂的速度遠大于瘤胃液的外流速度（稀釋率），但由于大部分微生物（包括細菌、原蟲和真菌等）是附著在飼料顆粒上的，因此，稀釋率是影響微生物生長和微生物蛋白質產(chǎn)量的重要因素之一。研究表明，在人工瘤胃中當微生物數(shù)量達到穩(wěn)定狀態(tài)時，稀釋率可以用來代表微生物的生長速度［4］。但關于稀釋率這一對微生物蛋白質合成有重要影響的因素的研究迄今尚不多見。這主要是由于對活體瘤胃稀釋率的研究尚存在一定的困難，同時用于體外瘤胃稀釋率研究的雙外流人工瘤胃裝置多為專利性設備且造價較高，以致目前一般的實驗室尚缺乏適宜實驗室研究用的體外仿真瘤胃微生物連續(xù)培養(yǎng)設備。因此，迄今多數(shù)有關體外培養(yǎng)條件下瘤胃稀釋率的報道還是以靜態(tài)培養(yǎng)（沒有培養(yǎng)液的連續(xù)注入和培養(yǎng)物的外排）為試驗條件［5－7］。現(xiàn)有可查的少量文獻是關于稀釋率影響瘤胃微生物蛋白質合成的［8－9］，而對于稀釋率調控原蟲蛋白質、細菌蛋白質等微生物蛋白質的合成規(guī)律，如不同稀釋率下以微生物蛋白質或其他形式存在的氮素的分配情況、微生物類群結構和生長速率、原蟲吞噬細菌的速率等，尚不得而知。為此，本試驗擬在體外連續(xù)培養(yǎng)條件下研究稀釋率對微生物蛋白質和其他形式氮素的流量以及其在總氮素流量中比例分配的影響，以為進一步研究稀釋率影響瘤胃微生物蛋白質合成規(guī)律提供一些基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與發(fā)酵裝置

選用5只健康、平均體重為（25.6±0.5）kg裝有瘤胃瘺管的成年徐淮白山羊羯羊，統(tǒng)一驅蟲，單圈飼養(yǎng)，按體重的2%干物質量給料，每日08：00和20：00分2次等量飼喂，自由飲水，用于提供瘤胃液以配制培養(yǎng)液。所用人工模擬瘤胃連續(xù)發(fā)酵裝置由本實驗室2011年完全自主研制完成。該發(fā)酵系統(tǒng)包括培養(yǎng)液罐以及發(fā)酵罐、溢流罐和集氣罐各6個，可進行連續(xù)1周穩(wěn)定的連續(xù)培養(yǎng)試驗，適用于瘤胃微生物體外連續(xù)培養(yǎng)，底物消化率以及產(chǎn)氣測定等試驗研究，該設備同時配有自動采集發(fā)酵罐樣品的采集管等，操作方便簡捷。

1.2 試驗設計

以玉米、豆粕為精料，羊草為粗料，1mm粉碎，按精粗比40∶60（玉米∶豆粕∶羊草＝33∶7∶60）配制作為體外培養(yǎng)底物。表1為體外培養(yǎng)所用原料和培養(yǎng)底物的營養(yǎng)水平。采用單因子3水平試驗設計，因子為稀釋率，水平分別為4%/h、6%/h、8%/h，每個水平設3個重復。

1.3 體外培養(yǎng)

1.3.1 人工唾液鹽配制

常用緩沖液配方改進自McDougall緩沖液，具體組成見表2。人工唾液鹽以8L為1個配制單位，具體組成如下：雙蒸水6 974mL、緩沖液A（5×）960mL、礦物鹽溶液B（100×）48mL、尿素溶液C 16mL，充CO2備用。使用前加入結晶半胱氨酸鹽酸鹽2g。

1.3.2 瘤胃液采集

晨飼前，利用自制真空負壓裝置，通過瘤胃瘺管從5只山羊的瘤胃背囊、背盲囊、腹囊、腹盲囊4個位點采集瘤胃液各300mL，經(jīng)混合灌入經(jīng)預熱達39℃并事先通有CO2的保溫瓶中。迅速返回實驗室，經(jīng)4層紗布過濾后，濾液通CO2并預熱至39℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 體外培養(yǎng)試驗

每個培養(yǎng)罐中培養(yǎng)液均按人工唾液鹽與瘤胃液體積比為2∶1配制，每12h投放培養(yǎng)底物1次，投放量為20g/次，稀釋率按試驗設計設定，持續(xù)通CO2，39℃連續(xù)培養(yǎng)。

表1 原料和培養(yǎng)底物的營養(yǎng)水平 （干物質基礎）Table 1 Nutrient levels of ingredients and culture substrate（DM basis） %

表2 體外培養(yǎng)用人工唾液鹽的組成Table 2 Composition of artificial saliva salt in vitro

1.4 樣品采集

培養(yǎng)開始后，分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h采集培養(yǎng)罐中培養(yǎng)液樣品，立即于－20℃凍存，用于培養(yǎng)液中各種形態(tài)氮素的測定。

1.5 指標測定

1.5.1 常規(guī)營養(yǎng)成分的測定

培養(yǎng)底物及其原料的干物質、粗蛋白質、粗脂肪、灰分和中性洗滌纖維（NDF）含量參照張麗英［10］的方法測定，中性洗滌纖氮（NDFN）含量參照Licitra等［11］推薦的方法測定。

1.5.2 原蟲蛋白質和細菌蛋白質含量的測定

參考Wang等［12］的方法分離培養(yǎng)液樣品中的原蟲和細菌，主要步驟如下：取培養(yǎng)液樣品，加等體積生理鹽水，39℃、125r/min孵育60min，經(jīng)80目尼龍布過濾，濾液150×g離心15min，收集沉淀為原蟲；收集上述上清液，22 000×g離心20min，收集沉淀為細菌。采用三氯醋酸（TCA）沉淀蛋白質法測定原蟲蛋白質和細菌蛋白質含量。主要步驟如下：取分離的原蟲或細菌樣品適量，加入10%TCA，混勻后置室溫30min，6 000×g離心10min，棄上清液再加入5%氫氧化鈉溶液混勻溶解后，6 000×g離心10min，取上清液用756型紫外分光光度計測定260和280nm下的吸光度值（OD260nm和OD280nm）。

原蟲蛋白質或細菌蛋白質含量（mg/mL）＝（1.45×OD280nm－0.74×OD260nm）×稀釋倍數(shù)。

1.5.3 可溶性蛋白質含量的測定

取培養(yǎng)液樣品于SK－1快速混勻器（廈門新科）振蕩靜置后經(jīng)4℃、20 000×g離心20min后，取上清液加入終濃度為0.15mol/L的高氯酸，靜置20min，再4℃、20 000×g離心20min；收集沉淀，加入2mol/L氫氧化鈉溶液水解，用考馬斯亮藍法測其可溶性蛋白質含量。所用試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.5.4 游離氨基酸氮含量的測定

取培養(yǎng)液樣品于4℃、20 000×g離心20min后，取上清液加入25%高氯酸，振蕩靜置后再次4℃、20 000×g離心20min；再取上清液加入2mol/L碳酸鉀溶液，振蕩靜置后再4℃、20 000×g離心20min；收集上清液用甲醛值法（GB/T 5009.39—2003）［13］測定游離氨基酸氮的含量。

1.5.5 肽含量的測定

采用雙縮脲法［14］測定培養(yǎng)液樣品中肽含量，主要步驟如下：取培養(yǎng)液樣品，加入10%TCA，混勻后靜置15min，4 000×g離心15min；取上清液加雙縮脲試劑充分混勻，室溫靜置30min，545nm下測定吸光度值。同時用牛血清白蛋白標準液重復上述步驟，做出標準曲線，進行樣品含量的換算。

1.5.6 氨氮含量的測定

參考馮宗慈等［15］的方法測定培養(yǎng)液樣品中氨氮含量，主要步驟如下：取培養(yǎng)液樣品，4 000×g離心10min，取上清液依次加入苯酚試劑和次氯酸鈉試劑，混合均勻后60℃水浴10min，冷水冷卻后，546nm下測定吸光度值。同時用氯化銨標準液重復上述步驟，做出標準曲線，進行樣品含量的換算。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003整理數(shù)據(jù)，以SPSS 13.0統(tǒng)計軟件的ANOVA模塊進行方差分析，并采用Duncan氏法分別在0.05和0.01水平進行差異顯著性比較，結果以平均值±標準誤表示。

2 結 果

2.1 稀釋率對原蟲蛋白質和細菌蛋白質含量動態(tài)變化的影響

4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下記錄的培養(yǎng)液中原蟲蛋白質含量的變動范圍分別為0.67～1.22mg/mL、0.56～1.20mg/mL、0.21～1.12mg/mL。從其24h內(nèi)的動態(tài)變化（圖1）看，各稀釋率下原蟲蛋白質含量均大致呈先上升后下降，再上升繼而再下降的趨勢；投料后6h時到達第1個高峰，而后下降；再次投料后6h即培養(yǎng)18h時達到第2個高峰，之后再下降。

4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下記錄的培養(yǎng)液中細菌蛋白質含量的變動范圍分別為0.68～0.88mg/mL、0.56～0.83mg/mL、0.34～0.78mg/mL。圖2表明，各稀釋率下細菌蛋白質含量變化均較為復雜，隨培養(yǎng)時間的延續(xù)大致呈先上升后下降，再上升和下降，再次投料后又先上升后下降，繼而又上升和下降的波動變化，培養(yǎng)6、10、18、22h時為峰值點。

圖1 培養(yǎng)液中原蟲蛋白質含量的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of protozoal protein content in culture solution

2.2 稀釋率對可溶性蛋白質和游離氨基酸氮含量動態(tài)變化的影響

4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下記錄的培養(yǎng)液中可溶性蛋白質含量的變動范圍分別為0.41～0.78mg/mL、0.40～0.77mg/mL、0.39～0.78mg/mL。從其24h內(nèi)的動態(tài)變化（圖3）看，各稀釋率下變化趨勢大致相同，均呈現(xiàn)出先下降后上升，再下降和上升的趨勢。其中，在投料后4h時出現(xiàn)第1個谷值，再次投料后4h即培養(yǎng)16h時出現(xiàn)第2個谷值。

4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下記錄的培養(yǎng)液中游離氨基酸氮含量的變動范圍分別為25.85～44.38μg/mL、25.08～38.24μg/mL、24.42～31.97μg/mL。其24h內(nèi)的動態(tài)變化見圖4，隨培養(yǎng)時間的延續(xù)，各稀釋率下均呈現(xiàn)先上升、下降再上升、下降，最后又上升的趨勢。其中，投料后到2h的時間內(nèi)上升，之后下降至4h，然后緩慢上升至12h；再次投料后變化趨勢一致，但游離氨基酸氮含量的整體波動水平略有所提高。

圖2 培養(yǎng)液中細菌蛋白質含量的動態(tài)變化Fig.2 Dynamics changes of bacterial protein content in culture solution

圖3 培養(yǎng)液中可溶性蛋白質含量的動態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of soluble protein content in culture solution

2.3 稀釋率對肽和氨氮含量動態(tài)變化的影響

4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下記錄的培養(yǎng)液中肽含量的變動范圍分別為10.88～21.97mg/dL、10.78～18.55mg/dL、9.58～15.19mg/dL。從圖5可知，各稀釋率下肽含量動態(tài)變化趨勢大致相同，均呈現(xiàn)出先升高后降低，而后又略有上升的趨勢。其中，投料后2h內(nèi)，各組肽含量均有大幅度上升，4%/h組和6%/h組先緩慢上升至6h再下降，而8%/h組持續(xù)下降，投料后10h為各組肽含量的最低點。

圖4 培養(yǎng)液中游離氨基酸氮含量的動態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of free amino acid nitrogen content in culture solution

圖5 培養(yǎng)液中肽含量的動態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes of peptide content in culture solution

圖6 培養(yǎng)液中氨氮含量的動態(tài)變化Fig.6 Dynamic changes of ammonia nitrogen content in culture solution

4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下記錄的培養(yǎng)液中氨氮含量的變動范圍分別為5.11～8.83mg/dL、4.28 ～ 8.50mg/dL、2.80 ～7.67mg/dL。由圖6可知，隨培養(yǎng)時間的延續(xù)，各稀釋率下氨氮含量均大致呈現(xiàn)先升高后下降，再升高和下降，后又有所升高的變化趨勢。其中，2、14h時為峰值點，而6和18h為谷值點。

2.4 稀釋率對培養(yǎng)液中氮素分配的影響

如表3所示，培養(yǎng)液中原蟲蛋白質和細菌蛋白質含量均隨稀釋率的升高呈現(xiàn)下降趨勢。其中，原蟲蛋白質含量4%/h組與8%/h組差異極顯著（P＜0.01），6%/h組與8%/h組差異顯著（P＜0.05），但4%/h組與6%/h組差異不顯著（P＞0.05）；細菌蛋白質含量4%/h組與8%/h組差異極顯著（P＜0.01），4%/h組與6%/h組差異顯著（P＜0.05），6%/h組與8%/h組差異顯著（P＜0.05）。培養(yǎng)液中可溶性蛋白質含量隨稀釋率的升高而下降，但各組間差異不顯著（P＞0.05）。培養(yǎng)液中游離氨基酸氮含量也隨稀釋率的升高而下降，僅4%/h組與8%/h組之間存在極顯著差異（P＜0.01）。隨著稀釋率的升高，培養(yǎng)液中肽和氨氮含量也呈下降趨勢。其中，肽含量4%/h組與8%/h組差異極顯著（P＜0.01），4%/h組與6%/h組差異顯著（P＜0.05），6%/h組與8%/h組差異極顯著（P＜0.01）；氨氮含量4%/h與8%/h組差異極顯著（P＜0.01），6%/h組與8%/h組差異顯著（P＜0.05），但4%/h組與6%/h組差異不顯著（P＞0.05）。

將所測各類別氮素指標轉化為氮量，按其稀釋率以24h計各類別氮素的流量及其在總氮素流量中所占比例，結果如圖7所示。隨著稀釋率的升高，各類別氮素流量都有所提高，但其在總氮素流量中所占比例有所不同。原蟲蛋白質中氮素流量 在 4%/h、6%/h、8%/h 稀 釋 率 下 分 別 為256.32、367.20、385.92mg/d，其在總氮素流量中所占比例范圍為29%～31%，以6%/h組的比例最高，為31%。細菌蛋白質中氮素流量在4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下分別為218.88、289.44、328.32mg/d，其在總氮素流量中所占比例范圍為24%～26%，隨稀釋率的升高而下降，以4%/h組的比例最高，為26%。微生物蛋白質（原蟲蛋白質和細菌蛋白質之和）中氮素流量和其在總氮素流量中所占比例在4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下分別為475.20mg/d和56%、656.64mg/d和56%、714.24mg/d和53%，以6%/h組流量相對較高，且比例沒有下降?？扇苄缘鞍踪|中氮素流量在4%/h、6%/h、8%/h稀 釋 率 下 分 別 為 178.56、263.52、345.60mg/d，其在總氮素流量中所占比例范圍為21%～26%，隨稀釋率的升高而升高，以8%/h組的比例最高，為26%。此外，不同稀釋率下，游離氨基酸氮、肽、氨氮中氮素流量在總氮素流量中所占比例范圍分別為6%、5%～6%、10%～11%，總體上變化不大。

表3 體外連續(xù)培養(yǎng)條件下稀釋率對培養(yǎng)液中各種氮素含量（24h均值計）的影響Table 3 Effects of dilution rate on various nitrogen contents（expressed as mean value of 24h）in culture solution under the condition of continuous culture in vitro

圖7 體外連續(xù)培養(yǎng)條件下稀釋率對培養(yǎng)液中氮素分配的影響Fig.7 Effects of dilution rate on nitrogen distribution in culture solution by in vitro continuous culture

3 討 論

本試驗結果表明，隨培養(yǎng)時間的延續(xù)，不同稀釋率下培養(yǎng)液中的原蟲蛋白質、細菌蛋白質、可溶性蛋白質、肽、游離氨基酸氮、氨氮的含量皆呈波動變化；再次投料后其變化趨勢基本一致。這可能是由于投料后微生物對培養(yǎng)液中含氮物質的降解、微生物增殖對可利用形式氮素的利用［16－18］、微生物生長的平臺期抑制、微生物間的互作等效應［19－20］以 及 微 生 物 本 身 的 自 溶［21］等 原 因 導 致 了所檢測的各種形式的氮素含量發(fā)生了波動變化。

在本試驗所設定的稀釋率范圍內(nèi)，原蟲蛋白質、細菌蛋白質、可溶性蛋白質、肽、游離氨基酸氮、氨氮的含量隨稀釋率的升高都有所下降。但是，按其稀釋率以24h計各類別氮素流量的結果表明，各類別氮素流量隨稀釋率的升高又都有所提高，以稀釋率為8%/h時的流量最高。這提示，一定范圍內(nèi)增加稀釋率提高了微生物蛋白質中氮素的流量（4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下原蟲蛋白質和細菌蛋白質之和的氮素流量分別為475.20、656.64、714.24mg/d）。對于原蟲，可能是由于稀釋率增加提高了內(nèi)容物的外排速率［22－24］，原蟲的外流量也隨之增加，進而減少了原蟲的滯留和自溶，而在總體上增加了原蟲蛋白質中氮素的流量。細菌蛋白質中氮素流量增加的結果與Isaacson等［25］和 Maeng等［26］的研究結果一致。其原因可能是由于稀釋率提高降低了培養(yǎng)液中原蟲的含量，進而降低了原蟲吞噬細菌的能力［27－29］，使得培養(yǎng)液中細菌蛋白質流量增加；或者也可能是因為稀釋率增加提高了內(nèi)容物的外排速率，促進了培養(yǎng)液中細菌增殖活性和細菌蛋白質合成效率［26］所致。但該結果與Martínez等［30］得到的隨稀釋率的增加液相菌增加而固相菌減少不盡一致，其原因可能是由于研究的對象（細菌vs.液相菌和固相菌）、設 置 的 稀 釋 率 （4%/h、6%/h、8%/h vs.3.78%/h、5.42%/h）等都有所不同所致。由此也說明，稀釋率對微生物蛋白質中氮素影響規(guī)律與機制的闡明還需要進一步開展深入的試驗研究。

在本試驗設置的稀釋率范圍內(nèi)，隨稀釋率的升高，24h內(nèi)微生物蛋白質中氮素流量增加。但微生物蛋白質中氮素的比例分配是否也有同樣的趨勢呢？本研究還同時對不同稀釋率下各類別氮素流量在總氮素流量中的比例變化情況進行了研究。結果表明，原蟲蛋白質中氮素流量在總氮素流量中所占比例在4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下分別為30%、31%、29%，以稀釋率為6%/h時的比例最高；而細菌蛋白質中氮素流量在總氮素流量中所占比例則隨稀釋率的升高持續(xù)下降，在4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下分別為26%、25%、24%，以稀釋率為8%/h時的比例最低；而微生物蛋白質（原蟲蛋白質和細菌蛋白質之和）中氮素流量在總氮素流量中所占比例在4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下分別為56%、56%、53%，以稀釋率8%/h時比例較低。以上結果提示，在本試驗底物精粗比40∶60的條件下，稀釋率對微生物蛋白質中氮素流量在總氮素流量中的比例有調控效應，以稀釋率為6%/h時的原蟲蛋白質中氮素在總氮素流量中所占比例最高（31%vs.30%、29%），此稀釋率下細菌蛋白質中氮素在總氮素流量中所占比例的下降不大（25%vs.26%、24%），微生物蛋白質（原蟲蛋白質和細菌蛋白質之和）中氮素在總氮素流量中所占比例尚未下降（56%vs.56%、53%），而且此時氮素流量（4%/h：475.20mg/d；6%/h：656.64mg/d；8%/h：714.24mg/d）也 較高。此外，可溶性蛋白質中氮素流量在總氮素流量中所占比例隨稀釋率的升高持續(xù)增加，在4%/h、6%/h、8%/h稀釋率下分別為21%、22%、26%，推測可能是由于稀釋率的升高降低了培養(yǎng)液中微生物蛋白質的含量，進而降低了微生物對培養(yǎng)液中可溶性蛋白質的代謝利用率所致。其中，稀釋率為6%/h時的影響尚不明顯（22%vs.21%），而稀釋率為8%/h時的影響已經(jīng)較為明顯（26%vs.21%）。綜上，在底物精粗比40∶60條件下，在一定范圍內(nèi)改變稀釋率可調控培養(yǎng)液中氮素的流量和其比例分配，并以稀釋率為6%/h時的微生物蛋白質中氮素流量和其在總氮素流量中所占比例較高。

4 結 論

稀釋率影響體外連續(xù)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)液中氮素的流量和比例分配，并以稀釋率為6%/h時的微生物蛋白質中氮素流量和其在總氮素流量中所占比例（流量656.64mg/d、占總氮素流量比例56%）較高。

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