孫曉春 孫 敏 謝 巖 吳樂樂 朱 偉 陳巧林 陸榮柱 許文榮

(江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSC)是一類具有自我更新、增殖和多向分化潛能的干細(xì)胞〔1～3〕，具有來源易得、易于分離培養(yǎng)、免疫原性較弱、無倫理學(xué)爭(zhēng)議等諸多優(yōu)點(diǎn)。還原型谷胱甘肽(GSH)廣泛分布于人體各器官內(nèi)，對(duì)維持細(xì)胞生物功能，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，對(duì)抗細(xì)胞衰老都有著重要作用〔4〕。因hUC-MSC在體外擴(kuò)增時(shí)并非無限增殖，通常擴(kuò)增7～10代左右就趨于老化而停止增殖，使得其實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制。本研究擬通過一定濃度的GSH來促進(jìn)hUC-MSC細(xì)胞增殖并對(duì)抗其衰老，從而使其在體外得以充分?jǐn)U增以滿足臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 胎牛血清、DMEN1(GIBCO)，胰酶(SIGMA)，PI(INVITROGEN)，CD29PE、CD34FITC、CD44PE(BD)。

1.2 方法

1.2.1 hUC-MSC的分離培養(yǎng) 取新鮮無菌的臍帶組織，先用PBS沖洗，沖去臍靜脈及動(dòng)脈內(nèi)的殘存血，剔除臍帶組織內(nèi)的血管，將剩余組織剪碎至1 mm3大小的組織塊。組織塊接種于含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)液(含青霉素105U/L，鏈霉素100 mg/L)2 ml的直徑為3 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，放置于37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)。3 d后，首次換液，以后隔2 d換一次液，兩周后剔除組織塊。細(xì)胞長(zhǎng)到80%融合時(shí)，用含0.1 mmol/L EDTA-Na2的0.25%胰酶室溫消化，以1×105的細(xì)胞個(gè)數(shù)接種于傳代培養(yǎng)瓶(T-25)中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.2.2 GSH對(duì)hUC-MSC活性的影響 取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hUC-MSC，0.25%的胰酶消化后，用含10%FBS的DMEM營(yíng)養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，接種每孔1×103個(gè)細(xì)胞于96孔板。每孔加入100μl營(yíng)養(yǎng)液。置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，換用含2%FBS的DMEM營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的 GSH(用2%FBS的 DMEM營(yíng)養(yǎng)液配制)，設(shè)0.09、0.12、0.15、0.18、0.21 mg/ml等5 個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè) 11 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后每孔加入20μl MTT。置37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)上清液，每孔加入150μl DMSO，振蕩器振蕩10 min后酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)儀上570 nm測(cè)吸光度值。

1.2.3 GSH對(duì)hUC-MSC增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hUCMSC，用0.25%的胰酶消化，計(jì)數(shù)離心，用含10%的 FBS的DMEM營(yíng)養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，接種于2只24孔板內(nèi)，每孔1 000個(gè)細(xì)胞。8 h后，其中一只24孔板換含2%FBS的DMEM營(yíng)養(yǎng)液，另一只板加入含0.15 mg/ml GSH的2%FBS的DMEM營(yíng)養(yǎng)液，于加藥后的第2天開始計(jì)數(shù)復(fù)孔取均值并繪制生長(zhǎng)曲線。并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期傳代。

1.2.4 GSH對(duì)hUC-MSC細(xì)胞周期的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化后，用含10%FBS的DMEM營(yíng)養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，接種于六孔板內(nèi)，換用5%FBS的營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，加入終濃度為0.15 mg/ml的GSH，再培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，設(shè)空白對(duì)照組，每管加入500μl PI，避光30 min，用濾網(wǎng)過濾成單個(gè)細(xì)胞懸液，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 GSH對(duì)hUC-MSC表面標(biāo)志物的影響 取第3代的hUC-MSC，用0.25%的胰酶消化，平均分兩瓶，一瓶加入10%FBS的DMEM營(yíng)養(yǎng)液，另一瓶加入含0.15 mg/ml GSH的10%FBS的DMEM營(yíng)養(yǎng)液。次日消化收集細(xì)胞，一瓶分四管，一管作對(duì)照，其余三管分別加入鼠抗人的 CD29PE、CD34FITC、CD44PE，冰上避光染色30 min，用濾網(wǎng)過濾成單個(gè)細(xì)胞懸液上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 GSH對(duì)hUC-MSC成骨分化的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hUC-MSC，用0.25%的胰酶消化，計(jì)數(shù)離心，用含10%的FBS的DMEM營(yíng)養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液，接種于24孔板內(nèi)，每孔4 000個(gè)細(xì)胞。次日10只孔加入成骨誘導(dǎo)液(含終濃度地塞米松0.1 μmol/L、維生素 C 50 mg/L、β2磷酸甘油 10 mmol/L、bFGF 4 mg/L)，再取10只孔加含0.15 mg/ml GSH的成骨誘導(dǎo)液，剩余4只孔做空白對(duì)照。誘導(dǎo)14 d后進(jìn)行ALP染色。計(jì)算ALP陽性細(xì)胞百分率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行配對(duì)資料的t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 GSH對(duì)hUC-MSC細(xì)胞活性的影響(MTT法檢測(cè)) 加入不同濃度的GSH后，hUC-MSC的活性是不同的。0.09、0.12、0.15及0.18mg/ml GSH，hUC-MSC活性分別為:0.22、0.29、0.31、0.14、0.12，其中0.15 mg/ml吸光度均值最高，其后隨著GSH濃度加大，細(xì)胞增殖逐步受抑。

2.2 GSH對(duì)hUC-MSC增殖的影響 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示，實(shí)驗(yàn)前4 d生長(zhǎng)曲線無顯著性差異，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，GSH組要快于對(duì)照組，并提前到達(dá)平臺(tái)期(圖1)。對(duì)細(xì)胞傳代結(jié)果顯示，未加GSH組約可傳代9～10代細(xì)胞老化較為嚴(yán)重，鏡下顆粒化明顯，增殖非常緩慢。而加入GSH組可傳代12～13代后細(xì)胞老化較為嚴(yán)重。

2.3 GSH對(duì)hUC-MSC周期的影響 細(xì)胞周期結(jié)果顯示GSH未處理組S期比例為(9.7±3.5)%，GSH處理組S期比例為(21.5±6.0)%，兩組間存在顯著性差異(P＜0.01)。

2.4 GSH對(duì)hUC-MSC表面標(biāo)志的影響 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，與對(duì)照組相比加入GSH組hUC-MSC表面標(biāo)志CD44、CD29陽性表達(dá)，CD34陰性表達(dá)，與對(duì)照組結(jié)果完全一致，提示GSH對(duì)hUC-MSC表面標(biāo)志無明顯影響。

2.5 GSH對(duì)hUC-MSC成骨分化的影響 成骨誘導(dǎo)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組表達(dá)ALP陽性細(xì)胞率在1%左右，不加GSH成骨誘導(dǎo)后ALP陽性細(xì)胞表達(dá)率在45%，而GSH組的ALP陽性細(xì)胞表達(dá)率在46%，兩者間無明顯差異(P＞0.05)。見圖2。

圖1 GSH對(duì)hUC-MSC增殖的影響

圖2 GSH對(duì)hUC-MSC成骨分化ALP染色的影響(×200)

3 討論

人間質(zhì)干細(xì)胞是目前干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)之一，可來自骨髓、脂肪組織、臍帶等多種來源〔5～7〕，其在體外容易擴(kuò)增培養(yǎng)，我們?cè)诙嗄甑腗SC研究過程中注意到一個(gè)關(guān)鍵性的實(shí)際問題，即人的MSC在體外培養(yǎng)時(shí)其擴(kuò)增代數(shù)有限，分離培養(yǎng)幾代后人的MSCs即趨于老化而停止增殖。GSH在體內(nèi)具有較好的抗自由基抗氧化作用，可以延緩細(xì)胞衰老。細(xì)胞內(nèi)外的GSH水平與細(xì)胞的生長(zhǎng)速度有著一定的相關(guān)性，劉梅等〔8〕發(fā)現(xiàn)在一濃度范圍內(nèi)，GSH可促進(jìn)肝細(xì)胞增殖;Schneildorfer等〔9〕報(bào)道生長(zhǎng)迅速的腫瘤細(xì)胞對(duì)GSH的需求量顯著增加。本研究發(fā)現(xiàn)在低于0.15 mg/ml GSH作用時(shí)，其可以促進(jìn)hUC-MSC的增殖，并隨濃度增加而促進(jìn)作用增加，但如果濃度高于0.15mg/ml時(shí)，則隨濃度增加對(duì)細(xì)胞增殖出現(xiàn)逐步抑制。

本研究應(yīng)用0.15 mg/ml GSH處理hUC-MSC后細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)可以明顯提高S期細(xì)胞比例，從細(xì)胞生長(zhǎng)曲線也可發(fā)現(xiàn)其可以縮短細(xì)胞達(dá)到生長(zhǎng)平臺(tái)期的時(shí)間。傳代結(jié)果也顯示GSH對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)傳代代數(shù)可起到一定的延長(zhǎng)作用。GSH促進(jìn)hUC-MSC活性的機(jī)制目前尚不明確，低濃度時(shí)可能通過GSH的抗氧化作用，清除自由基，增強(qiáng)呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ的活性，保護(hù)線粒體正常功能〔10〕從而促進(jìn)hUC-MSC的增殖。

那么GSH在促進(jìn)hUC-MSC增殖的前提下，是否會(huì)對(duì)MSC細(xì)胞的一些生物學(xué)特性帶來改變呢?我們采用MSC表面陽性標(biāo)志CD44、CD29與陰性標(biāo)志CD34來觀察應(yīng)用GSH處理后的變化，發(fā)現(xiàn)GSH處理后對(duì)細(xì)胞的表面標(biāo)志沒有帶來明顯的改變。我們又進(jìn)一步研究了GSH是否會(huì)對(duì)MSC的分化潛能帶來改變，我們應(yīng)用較成熟的成骨細(xì)胞誘導(dǎo)方案〔11〕，發(fā)現(xiàn)GSH處理前后，誘導(dǎo)后ALP陽性表達(dá)率無顯著性差異。

綜上所述，可以得知，在較低劑量的GSH除可促進(jìn)細(xì)胞的增殖速度延緩老化時(shí)間外，對(duì)hUC-MSC的細(xì)胞表面分子特征無明顯改變，對(duì)細(xì)胞分化的潛能也無明顯影響。因此，采用GSH可以在一定程度上提高M(jìn)SCs的增殖速度延長(zhǎng)傳代代數(shù)，可以應(yīng)用于MSCs的體外細(xì)胞培養(yǎng)與擴(kuò)增。

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