鐘 飛 周衛(wèi)華 石慧娟 張 潔

(吉首大學醫(yī)學院，湖南 吉首 416000)

心肌細胞凋亡是在一定生理和病理條件下，通過特殊信號轉導途徑，激活細胞“自殺”程序，在基因調控下進行的程序化死亡。目前認為心肌細胞凋亡是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的細胞學基礎，在心肌病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用〔1〕。死亡結構域相關蛋白(Daxx)是Yang等〔2〕在1997年發(fā)現的一種Fas死亡結構域結合蛋白，可激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路誘導細胞凋亡;研究顯示，干預Daxx在心肌中的表達，可減少大鼠心肌梗死的面積與心肌細胞的凋亡〔3〕，我們推測Daxx可能成為調節(jié)細胞凋亡新的重要藥理作用靶點，我們以前的研究表明黃芪甲甙具有減少阿霉素性心肌病心肌細胞凋亡作用，本研究在前期工作的基礎上，進一步探討黃芪甲甙調控心肌細胞凋亡的作用機制，為開發(fā)研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠40只，SPF級，體重200～250 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。

1.2 實驗試劑與材料 黃芪甲甙(成都錦泰和醫(yī)藥化學技術有限公司)用助溶劑羧甲基纖維素鈉制成所需濃度，DEPC(Sigma公司)，Trizol試劑(Invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒(Promega公司)，氯仿(國藥集團化學試劑公司)，異丙醇(國藥集團化學試劑公司)，瓊脂糖(Sigma公司)、乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 主要實驗儀器 TGL-16G冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠生產);723可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司);萊卡切片機(RM2126);全自動生物組織脫水機(YD-12G);生物組織包埋機(YD-6L);DYY-Ⅲ穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一廠)，DYCZ水平電泳槽(北京六一廠)，天能1600R凝膠成像分析系統。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組及干預方法 大鼠隨機分為4組，即正常組、模型組、黃芪甲甙高劑量組，黃芪甲甙低劑量組，每組10只。正常組采用生理鹽水0.6 ml腹腔注射，隔日1次，共6次，同時用1%羧甲基纖維素鈉1 ml，每天1次灌胃。模型組采用阿霉素造模〔4〕(2.5 mg/kg，隔日 1次腹腔注射，共 6次，總劑量為15 mg/kg);同時灌胃給予1%羧甲基纖維素鈉1 ml，每天1次。黃芪甲甙處理組造模方法同模型組，高低劑量組同時分別灌胃給予黃芪甲甙90 mg/kg和30 mg/kg〔5〕(用1 ml 1%甲基纖維素鈉溶解)，每天1次灌胃，連續(xù)2 w，最后一次阿霉素處理24 h后，用20%烏拉坦4 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，摘取心臟取血，心臟沿左心室中線切為兩半，一半用甲醛固定，石蠟包埋后作病理組織學檢查。

1.4.2 心肌病理學檢測 大鼠心肌10%的甲醛固定24 h，常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，切片，片厚5μm，HE染色，200倍光鏡下觀察心肌病理改變，并根據Kishimoto方法〔6〕計算心肌病變積分，即每張切片隨機取5個高倍視野，計算每個視野中炎性細胞浸潤及壞死區(qū)域面積與整個視野的面積之比，無病變計0分，病變面積 ＜25% 計1分，25% ～ 50%計2分，50% ～75%計3分，＞75%計4分。

1.4.3 血清ALT和AST的活性測定 最后一次阿霉素處理24 h后，用20%的烏拉坦麻醉大鼠，心臟取血，3 500 r/min離心15 min，取上清，嚴格按試劑盒說明書進行操作，測定血清CK和LDH活性。

1.4.4 RT-PCR檢測Daxx表達 取心肌20 mg剪碎，采用Trizol試劑1 000μl一步法提取心肌總RNA，應用UV-3100型紫外光光度計檢測樣品吸光度A，A260/A280為1.8～2.0。應用RT-PCR法檢測大鼠心肌組織的Daxx mRNA的表達。Daxx上游引物:5'-TCCAACCCAGCCTCTAATCC-3'，下游引物:5'-TAGCCCTCCCAGTATCTCGT-3'，β-actin 上 游 引 物:5'-ATGTGCAAAGCCGGCTTC-3'，β-actin 下游引物 5'-GGCTGGGGTGTTGAAGGTCT-3'，反應條件為:94℃變性 50 s，58℃ 退火 40s，72℃延伸60 s。反應產物用1% 瓊脂糖凝膠電泳(100 V，40 min)，紫外燈下觀察結果并攝片，用凝膠成像分析系統掃描，進行圖像分析，吸光面積積分比值表示DNA含量，以Daxx與β-actin擴增條帶的吸光面積積分比值評定Daxx mRNA表達水平。

1.5 統計學方法 所有計量數據采用x±s表示，采用SPSS16.0統計軟件進行分析，組間比較用方差分析，兩兩比較用S-N-K法。

2 結果

2.1 黃芪甲甙對阿霉素大鼠心肌組織病理的影響 對照組心肌細胞排列整齊，胞核清晰，無心肌纖維的破壞，細胞間隙正常，未見水腫，組織間隙無炎性滲出。模型組心肌細胞腫脹，排列紊亂，心肌纖維減少，肌原纖維斷裂，多灶性變性和壞死，心肌壞死灶內可見單核、淋巴細胞浸潤。高劑量組和低劑量處理組上述病變明顯減輕，尤以高劑量組最為明顯，心肌細胞變性壞死顯著減少，肌原纖維排列較整齊，心肌間僅見部分紅細胞浸潤。高劑量干預組和低劑量干預組心肌病理積分明顯低于模型對照組(P＜0.05)。見圖1和表1。

2.2 心肌生化指標 模型組大鼠心肌組織LDH和CK活性升高，與正常組相比有統計學意義(P＜0.05);灌胃給予高低不同劑量黃芪甲甙后，大鼠心肌組織LDH和CK活性下降，與模型組相比有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.3 RT-PCR檢測Daxx表達 與正常組相比，模型組大鼠心肌組織Daxx mRNA增加至正常水平的(1.65±0.22)倍(P＜0.01)，黃芪甲甙低劑量和高劑量灌胃給藥后大鼠心肌組織中daxx的表達分別為正常水平的(1.19±0.10)和(1.48±0.12)倍，與模型組相比顯著性差異(P＜0.05)。見圖2。

圖1 黃芪甲甙對阿霉素大鼠心肌組織病理的影響(HE染色，×400)

表1 黃芪甲甙對大鼠心肌組織病理積分，LDH和CK活性的影響(x ± s，n=10)

圖2 心肌組織中Daxx表達水平的變化

3 討論

普遍認為阿霉素誘導的心肌損傷與過量氧自由基的產生有關〔7〕，它導致細胞膜脂質過氧化，導致細胞膜的直接損害〔7〕，導致CK和LDH的含量升高。黃芪甲甙為中藥黃芪的重要的活性成分，研究表明其對病毒性心肌炎具有良好的治療效果，能改善病毒性心肌病大鼠心功能、減輕心肌病理改變〔8，9〕。我們以前的研究證實黃芪甲甙可以顯著減少阿霉素所誘導的心肌細胞凋亡〔10〕。本實驗病理結果分析表明黃芪甲甙可顯著減輕阿霉素心肌病大鼠的心肌病理損害，降低其血清CK和LDH活性，保護心肌細胞，從而治療阿霉素心肌病。

近年來的研究證實ADR導致心肌細胞凋亡在其對心肌的毒性損傷機制中起重要的作用〔10〕。Fas為死亡受體，屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族成員。FasL為死亡因子，是Fas的天然配體，當表達Fas的靶細胞和活性細胞的FasL交聯后，啟動凋亡信號傳導途徑，從而激活Fas/FasL途徑下游的ICE相關蛋白酶系列，引起核酸內切酶活化，降解DNA修復酶及細胞骨架調節(jié)蛋白，最終導致Fas表達陽性的靶細胞凋亡〔11〕。Fas/FasL系統介導的凋亡信號傳導途徑是許多心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要機制〔12〕。研究首先證實Daxx在氧化應激誘導的細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，H2O2處理細胞能誘導Daxx表達上調，而用反義寡核苷酸抑制Daxx的表達能抑制H2O2誘導的細胞凋亡。Yaniv等〔13〕研究進一步探明了Daxx誘導細胞凋亡的作用機制，首先H2O2激活Fas，Fas的死亡結構域 DD區(qū)可與Daxx的C末端一個功能區(qū)結合，通過激活JNK途徑而啟動凋亡的發(fā)生。我們的實驗結果表明，Daxx在阿霉素心肌病大鼠心肌中表達升高，表明Daxx可能通過Fas-Daxx-JNK介導了阿霉素誘導的細胞凋亡。

綜上所述Daxx在阿霉素心肌病大鼠心肌中表達上調，并在阿霉素心肌病的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用，黃芪甲甙能下調Daxx的表達，減輕病理損害，其機制可能與抑制細胞凋亡等保護心肌細胞等作用有關。

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2 Yang X，Khosravi-Far R，Chang HY，et al.Daxx，a novel Fas-binding protein that activates JNK and apoptosis〔J〕.Cell，1997;89(7):1067-76.

3 Roubille F，Combes S，Leal-Sanchez J，et al.Myocardial expression of a dominant-negative form of Daxx decreases infarct size and attenuates apoptosis in an in vivo mouse model of ischemia/reperfusion injury〔J〕.Circulation，2007;116(23):2709-17.

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5 李 麗，陶輝宇，陳杰斌，等.黃芪甲甙保護阿霉素心肌損傷大鼠抗凋亡作用的機制研究〔J〕.中國中西醫(yī)結合雜志，2006;26(11):1011-4.

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9 羅永姣，劉紅英，李雙杰.小鼠柯薩奇B3病毒性心肌炎心臟炎癥細胞因子基因和蛋白表達及黃芪甲甙干預研究〔J〕.中國動脈硬化雜志，2009;17(2):122-4.

10 鐘 飛，李 輝，周衛(wèi)華.黃芪甲甙對大鼠阿霉素心肌細胞凋亡的影響〔J〕.吉首大學學報(自然科學版)，2008;29(6):104-6.

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13 Yaniv G，Shilkrut M，Larisch S，et al.Hydrogen peroxide predisposes neonatal rat ventricular myocytes to Fas-mediated apoptosis〔J〕.Biochem Biophys Res Comm，2005;336(3):740-6.