梁莉萍 賈存東
(新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科,新疆 烏魯木齊 830011)
癌前病變是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的必經(jīng)階段,而在該階段采取積極的治療措施可以延緩甚至逆轉(zhuǎn)癌變的進程〔1〕。莪術(shù)油是我國傳統(tǒng)中藥,具有活血化瘀之功效,已被廣泛應(yīng)用于肝癌、大腸癌、胃癌等腫瘤的治療中〔2,3〕。有研究顯示莪術(shù)油對于乳腺癌癌前病變具有良好的治療效果〔3〕,然而其深入的分子機制尚不清楚。本研究以化學致癌劑二甲基苯蒽(DMBA)誘導大鼠乳腺癌癌前病變模型,觀察莪術(shù)油作用后,大鼠乳腺癌癌前病變組織病理形態(tài)及P53蛋白的表達改變。
1.1 實驗動物和試劑 選擇健康未育雌性SD大鼠80只,6周齡,清潔級,體重185~235 g,常規(guī)飼養(yǎng)1 w,適應(yīng)環(huán)境后開始實驗。DMBA(Sigma公司,產(chǎn)品編號165023)1 g加入100 ml芝麻油備用;莪術(shù)油注射液(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司,國藥準字H20053467);康萊特注射液(浙江康萊特藥業(yè)有限公司,國藥準字Z20030004);他莫昔芬(江蘇揚子江藥業(yè)集團有限公司,國藥準字H32021472);脫毛膏(廣州市卡梅奧化妝品有限公司,批號:K005041302);即用型SABC試劑盒、DAB二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒(上海長島生物技術(shù)有限公司);兔抗人/大/小鼠P53抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);照相顯微鏡:Leica;顯微數(shù)碼攝像圖像采集系統(tǒng):Pixera;隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱:Thermo。
1.2 造模方法 動物適應(yīng)環(huán)境1 w后,將DMBA 10 mg一次性灌胃后第2天起,按照5 d為1個周期,連續(xù)12個周期。第1~3天,每天腹腔注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg,第4天,腹腔注射黃體酮4 mg/kg,停藥1 d。
1.3 分組及給藥方法 分為5組各15只:①空白對照組,一次性灌胃生理鹽水10 ml/kg;第10周開始生理鹽水10 ml/kg腹腔注射,常規(guī)飼養(yǎng)14 w;②疾病模型組,造模結(jié)束后,第10周開始生理鹽水10 ml/kg腹腔注射,常規(guī)飼養(yǎng)14 w;③莪術(shù)油組,造模結(jié)束后,第10周開始莪術(shù)油20 ml/kg腹腔注射,治療4 w;④康萊特組,造模結(jié)束后,第10周開始康萊特20 ml/kg腹腔注射,治療4 w;⑤他莫昔芬組,造模結(jié)束后,第10周開始他莫昔芬20 ml/kg灌胃,治療4 w。
1.4 觀察指標 造模結(jié)束后,每日觀察大鼠一般生理情況。實驗結(jié)束前1 d用脫毛劑將大鼠胸部毛發(fā)去除,實驗結(jié)束當天以1%戊巴比妥鈉40 ml/kg腹腔注射麻醉后處死大鼠,取胸腹部第3、4、5對乳腺及其周圍皮膚,皮下組織,經(jīng)中性甲醛溶液固定,梯度乙醇脫水后石蠟包埋切片,分成2份,1份經(jīng)HE染色,光鏡觀察乳腺組織學情況,大鼠乳腺組織病理學診斷標準參照2003年AHO制定的分類標準〔4〕。另1份石蠟包埋組織切片采用SP二步法行免疫組織化學染色,檢測P53蛋白表達情況。將獲取的標本進行抗原修復,然后滴加3%過氧化酶阻斷劑室溫反應(yīng)10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化酶的活性。加一抗4℃冰箱過夜,依次加入生物素標記的二抗及SABC試劑,然后進行DAB顯色,蘇木素復染,常規(guī)脫水,透明封片。具體步驟參照即用型快捷免疫組化SABC試劑盒(鼠/兔)說明書。以PBS液代替一抗作為陰性對照,以已知陽性表達的宮頸癌標本作為陽性對照。
1.5 統(tǒng)計學方法 用SPSS10.0軟件,數(shù)據(jù)用x±s表示,采用單因素方差分析,率的比較采用χ2檢驗。
2.1 大鼠存活情況 大鼠DMBA灌胃2 w后各組均陸續(xù)出現(xiàn)死亡。至試驗結(jié)束時,空白對照組存活15只,疾病模型組,莪術(shù)油組和康萊特組各10只,他莫昔芬組9只,空白組死亡率顯著低于其他組別(P<0.05)。
2.2 大鼠試驗后乳房病理學情況 疾病模型組與空白對照組在大鼠乳腺組織病理形態(tài)結(jié)構(gòu)比上存在顯著差異,前者出現(xiàn)癌前病變形態(tài)的比例更高(P<0.05)。莪術(shù)油、康萊特及他莫昔芬乳腺癌癌前病變及浸潤癌出現(xiàn)率均較疾病模型組低(P<0.05)。其中,莪術(shù)油組乳腺癌癌前病變及浸潤癌顯著低于他莫昔芬組及康萊特組。見表1。
2.3 不同組別大鼠乳腺組織P53與Ki-67蛋白表達情況P53、Ki-67蛋白的表達主要在細胞核中,呈黃色或棕黃色??瞻讓φ战M大鼠乳腺組織中均未見P53、Ki-67蛋白表達。疾病模型組P53、Ki-67蛋白顯著高于其他組別(P<0.05),莪術(shù)油、康萊特及他莫昔芬組P53、Ki-67表達水平無顯著性差異(P>0.05)。見表2。
表1 各組大鼠乳房病理學情況〔n(%),n=15〕
表2 各組大鼠乳腺組織P53與Ki-67基因表達情況〔n(%),n=15〕
流行病學研究結(jié)果表明,乳腺癌的發(fā)生是一個多階段的模式,即“經(jīng)乳腺導管上皮細胞一般增生-非典型增生-原位癌-浸潤性癌變”的逐漸演變過程,在癌前病變期,即浸潤性癌前階段采取積極的干預措施可及時截斷甚至逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)展進程,取得滿意的治療效果〔1〕。遺憾的是,目前針對乳腺癌癌前病變尚無特異性的治療藥物,西藥治療往往具有較大的副作用,而中醫(yī)藥由于其安全、高效,個性化優(yōu)勢,在乳腺癌癌前病變的治療中獲得越來越多的關(guān)注。莪術(shù)油為傳統(tǒng)中藥莪術(shù)根莖中提取的揮發(fā)油,其主要活性成分為莪術(shù)醇和蓬術(shù)環(huán)氧酮、蓬莪術(shù)酮、蓬莪術(shù)環(huán)二烯等倍半倍萜類物質(zhì),具有抗腫瘤、抗血管生成、抗病毒、抗菌、抗炎等作用。宋愛莉等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)莪術(shù)油可改善乳腺癌癌前病變造模大鼠的血液流變學,增加乳房的微循環(huán)灌注量,促進乳腺癌細胞凋亡。此外,殷玉坤等〔5〕對莪術(shù)油在乳腺癌癌前病變的應(yīng)用進行了大量研究,均證實其可有效抑制乳腺癌的繼續(xù)發(fā)展。本研究結(jié)果進一步證實了莪術(shù)油治療乳腺癌癌前病變的確切療效。
P53基因定位于人17號染色體(17p13.1),包括11個外顯子和10個內(nèi)含子,是最受矚目的抑癌基因。野生型P53蛋白半衰期短,積聚水平低,不宜測出,而突變型P53蛋白半衰期長,穩(wěn)定性強,可用免疫組化方法檢測到〔6〕。殷玉坤等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)P53基因突變與乳腺癌的惡性程度相關(guān)。本研究顯示莪術(shù)油治療后,大鼠乳腺組織中P53蛋白表達降低,這可能是由于莪術(shù)油可降解突變型P53,甚至將其逆轉(zhuǎn)為野生型P53。惡性腫瘤的基本特征之一是腫瘤細胞無限增殖,Ki-67表達在所有活動的細胞周期(G1,S,G2和有絲分裂期),被認為是評價腫瘤細胞增殖程度的良好指標〔7〕。本研究顯示莪術(shù)油可顯著抑制Ki-67的表達,與國外研究〔8〕一致。
綜上所述,莪術(shù)油可以顯著延緩大鼠乳腺癌癌前病變的發(fā)生發(fā)展,抑癌基因P53與原癌基因Ki-67可能與其抑癌作用機制密切相關(guān),因而可作為分子標志物用于臨床乳腺癌癌前病變的診斷和治療。
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