蔡玉春，盧 艷，陳韶紅，郭 儉，陳木新，田利光，張玲玲，周 洋，陳家旭

2010年河南、安徽等地發(fā)生因蜱蟲叮咬引發(fā)人相關(guān)疾病流行的報道引人關(guān)注。蜱可傳播多種疾病，已經(jīng)確認(rèn)經(jīng)蜱叮咬感染人的巴貝蟲只有4種，即：微小巴貝蟲（Babesiamicroti）也稱田鼠巴貝蟲；牛巴貝蟲（B.bovis），歧異巴貝蟲（B.divegen）；和馬巴貝蟲（B.equi），至少還有3種未定種的巴貝蟲也可以感染人體。其中以微小巴貝蟲感染為多見［1－8］。本文以引進的微小巴貝蟲建立動物模型，觀察其在不同免疫狀態(tài)動物體內(nèi)的動態(tài)規(guī)律，為巴貝蟲病致病機制、診治技術(shù)及防控措施等研究奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 蟲株 微小巴貝蟲（Babesiamicroti），peabody mjr株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC），貨號：PRA－99

1.1.2 實驗動物 BALB/c小鼠、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠（severe combined immune deficiency，SCID）、非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠（nonobese diabetic/severe combined immunodeficient，NOD/SCID）均購自中科院上海實驗動物中心。

1.2 儀器和試劑 顯微鏡（日本奧林巴斯公司），EDTA抗凝采血管（浙江拱東醫(yī)療科技有限公司），0.9%生理鹽水（上海長富制藥公司），地塞米松（山東新華制藥公司），吉姆薩染液原液（上海怡成生物科技公司），甲醇（上海振興化工一廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 BALB/c小鼠免疫抑制 3周齡雌性BALB/C小鼠腹腔注射地塞米松，0.5 mg/只，連續(xù)注射5 d。

1.3.2 動物接種 感染種鼠（紅細(xì)胞染蟲率，即蟲密度為60%）眶竇取血，置EDTA抗凝采血管中，在無菌條件下以1∶3比例加0.9%生理鹽水，使蟲密度約為20%，腹腔接種正常BALB/c小鼠、免疫抑制BALB/c小鼠、SCID小鼠以及NOD－SCID小鼠，100μL/只，每組5只，4只接種鼠，1只為正常鼠。

1.3.3 薄血片吉姆薩染色 從接種當(dāng)天及接種后每天尾部采血涂制薄血片，吉姆薩染色鏡檢觀察紅細(xì)胞染蟲率。

1.3.4 紅細(xì)胞染蟲率計算 油鏡下觀察染色血片，統(tǒng)計視野中每500個紅細(xì)胞的染蟲紅細(xì)胞數(shù)量，計算染蟲紅細(xì)胞占此500個紅細(xì)胞的百分率即為當(dāng)天的巴貝蟲染蟲率。

2 結(jié) 果

2.1 不同小鼠體內(nèi)B.microti動態(tài)變化情況BALB/c小鼠組感染后第3 d在紅細(xì)胞內(nèi)查見蟲體，之后紅細(xì)胞染蟲率升高，第4 d起紅細(xì)胞染蟲率即達20%，第7 d達到高峰（染蟲率82.4%），隨后蟲密度開始降低，染蟲率在20%以上約持續(xù)7天，至第20 d，染蟲率降為2.45%，隨后一直保持在0%－2%的較低水平狀態(tài)。免疫抑制BALB/c小鼠感染后第2 d查見蟲體，第3 d染蟲率達到20%以上，第5 d染蟲率最高，后緩慢降低，第12 d又出現(xiàn)染蟲率高峰為50.88%，至第16 d仍維持在20%以上，染蟲率在20%以上約持續(xù)14 d，第24 d后下降至2%以下，以后維持在0%～2%的較低水平。NODSCID小鼠感染后第3 d在紅細(xì)胞內(nèi)查見蟲體，第4 d蟲密度升高，第5 d時達20%，第7 d達高峰（染蟲率72.5%），隨后逐漸下降，第12 d降至低谷（染蟲率20.8%），隨后蟲密度再次升高，分別于第16 d、第24 d出現(xiàn)2次染蟲率升高又下降的過程，至觀察結(jié)束，平均染蟲率為41.9%。SCID小鼠于感染后第3 d紅細(xì)胞內(nèi)查見蟲體，第5 d開始上升，第8 d達高峰（染蟲率86.4%），隨后蟲密度逐漸下降，第12 d降至低谷，隨后蟲密度再次升高，至第18 d出現(xiàn)第二次染蟲率最高為62.2%，之后緩慢降低，至觀察的第30 d，染蟲率仍為31.4%，平均染蟲率為38.2%（圖1，表1）。

2.2 血涂片中巴貝蟲形態(tài) 在4種不同小鼠體內(nèi)，微小巴貝蟲蟲體寄生在紅細(xì)胞內(nèi)，多數(shù)為兩蟲寄生，有的多達6蟲寄生。蟲體很小，核呈紫色，漿呈蘭色，形態(tài)多種多樣，從點狀體、小的環(huán)狀形到大的阿米巴樣形不一，可呈淚滴狀、戒子狀、圓形、梨形、棒狀或歧異形。但以環(huán)狀體為主，還可見 四聯(lián)型”或“馬耳他十字型”。圖2中為在BALB/c小鼠薄血片中發(fā)現(xiàn)的比較典型的巴貝蟲形態(tài)：有小點狀體，馬耳他十字，小環(huán)狀體，環(huán)狀體，長絲狀體，以及感染高峰時段游離在紅細(xì)胞外大量蟲體。

表1 不同小鼠體內(nèi)B.microti動態(tài)變化Tab.1 Infection dynamics of Babesia microti in different groups

圖1 不同組小鼠染蟲率和時間的關(guān)系曲線圖A：BALB/c小鼠組；B：免疫抑制 BALB/c小鼠組；C：NOD－SCID小鼠組；D：SCID小鼠組.Fig.1 Infection dynamics curve of Babesia microti in different groupsA：BALB/c mice；B：BALB/c mice of immune suppression；C：NOD－SCID mice；D：SCID mice

2.3 巴貝蟲在不同組小鼠體內(nèi)形態(tài)變化情況 選取感染巴貝蟲的BALB/c小鼠、免疫抑制BALB/c小鼠、NOD－SCID小鼠、SCID小鼠第3 d、第7 d、第11 d、第15 d、第19 d和第23 d的血涂片來觀察巴貝蟲在不同小鼠體內(nèi)變化情況。巴貝蟲在BALB/c小鼠和免疫抑制BALB/c小鼠變化情況較為一致，在第四天出現(xiàn)少量環(huán)狀體，第7d紅細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量蟲體，紅細(xì)胞裂解，蟲體形態(tài)各異，小環(huán)狀體，大環(huán)狀體，長絲狀體等，有些為兩蟲、三蟲寄生，第11 d、第15 d仍有較多紅細(xì)胞被蟲體寄生，多為點狀體和小環(huán)狀體，至第19 d、第23 d染蟲紅細(xì)胞明顯大量減少，每視野中僅見2～4個環(huán)狀體。NOD－SCID小鼠組，第4 d也出現(xiàn)少量蟲體，多為單蟲寄生，環(huán)狀體，第7 d、第11 d大量紅細(xì)胞被蟲體感染，且出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，多為幼織紅細(xì)胞感染，多環(huán)狀體，少量蟲體游離在外；第15 d已有大量蟲體游離在外，紅細(xì)胞大量裂解，染蟲紅細(xì)胞多為2～4蟲感染，多大環(huán)狀體和長絲狀體；第19 d仍溶血嚴(yán)重，視野中僅可見少量紅細(xì)胞，多為新補充的幼織紅細(xì)胞，蟲體多為長絲狀體；第23 d紅細(xì)胞有所恢復(fù)，但仍舊可見較多點狀體、環(huán)狀體和長絲狀體等蟲體。SCID小鼠組同NOD－SCID小鼠組較為一致，每視野中染蟲紅細(xì)胞都較多，有溶血現(xiàn)象，至第23 d染蟲紅細(xì)胞數(shù)量無明顯下降（圖3）。

3 討 論

巴貝蟲是一類機會性致病寄生蟲，一些巴貝蟲也是人獸共患寄生蟲，如微小巴貝蟲、歧異巴貝蟲等，即可感染動物，也可機會性感染人。近年來，巴貝蟲在人體感染的病例時有報道，且呈世界性分布。不同人對巴貝蟲感染癥狀反應(yīng)不一。癥狀輕者體溫正常，略有不適；重者驟然發(fā)病，高熱，惡寒戰(zhàn)栗，頭痛劇烈，惡心嘔吐；危重患者甚至迅速發(fā)展為溶血性貧血，伴發(fā)黃疸、蛋白尿、血尿及腎功能障礙等，脾臟切除患者、老年以及細(xì)胞免疫功能低下患者，感染癥狀較正常人嚴(yán)重［9］。脊椎動物和蜱是巴貝蟲的兩個宿主，當(dāng)感染性蜱叮咬宿主吸血時，子孢子隨唾液進入宿主體內(nèi)，侵入紅細(xì)胞進行裂體增殖；部分裂殖子形成雄、雌配子體，配子體在蜱叮咬宿主時進入蜱體內(nèi)，進行配子生殖和包子增殖，在蜱唾液腺發(fā)育成孢子體，并通過蜱叮咬宿主時感染哺乳動物宿主，進入下一個循環(huán)［10］。隨著戶外活動的增加，人們暴露于蜱蟲叮咬的機會也增加，特別對于脾臟切除等免疫功能低下的患者，更易感染；另外，無癥狀的帶蟲者也可通過輸血傳播［11］。

本研究觀察了微小巴貝蟲感染不同免疫狀態(tài)BALB/c小鼠、SCID小鼠和 NOD－SCID小鼠后，紅細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)變化情況。由動態(tài)曲線圖可以看到，微小巴貝蟲感染正常BALB/c小鼠和免疫抑制的BALB/c小鼠，在免疫抑制的BALB/c小鼠體內(nèi)，感染后2 d就出現(xiàn)較多蟲體，出現(xiàn)兩次感染高峰，且感染時間較正常BALB/c小鼠長。在感染高峰時段，出現(xiàn)較多多蟲感染現(xiàn)象，但在觀察的30 d中，最終感染率會降至較低水平，第25 d后下降至2%以下，以后維持在0%～2%的較低水平。而SCID小鼠組和NOD－SCID小鼠組與這兩組BALB/c小鼠有很大不同，微小巴貝蟲在其體內(nèi)有感染率的上下波動，但一直處于較高水平，平均感染率NOD－SCID小鼠為41.9%，SCID小鼠組為38.2%。這一現(xiàn)象給我們很大的啟示，由于SCID小鼠是嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠，而NOD/SCID小鼠是SCID小鼠與非肥胖性糖尿病小鼠（NOD/Lt）品系回交的免疫缺陷鼠，不僅擁有C.B－17 SCID鼠的特征，缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，不再發(fā)生自身免疫性糖尿病，同時還表現(xiàn)出NOD小鼠所具有的多種固有免疫缺陷，包括NK細(xì)胞活性低、骨髓功能發(fā)育不正常（巨噬細(xì)胞對LPS反應(yīng)性分泌IL－1的能力下降）、約30%純合子無補體成分c5并缺乏補體系統(tǒng)的溶血活性［12－13］。所以，微小巴貝蟲蟲體在NOD/SCID小鼠和SCID小鼠體內(nèi)存活時間長，不被免疫系統(tǒng)清除，這提示NOD/SCID小鼠和SCID小鼠可能是保存微小巴貝蟲良好的動物模型，也是一個研究免疫反應(yīng)機理的很好的模型。

圖2 BALB/c小鼠體內(nèi)不同巴貝蟲形態(tài)A：點狀體；B：馬耳他十字；C：小環(huán)狀體；D：環(huán)狀體；E：長絲狀體；F：細(xì)胞外蟲體Fig.2 Blood smear of BALB/c mice infected with Babesia microtiA：Small point－like body；B：Maltese cross；C：A small circular ring；D：Circular ring；E：Long threadlike body；F：Parasites free outside of red blood cells.

圖3 不同組小鼠感染巴貝蟲血涂片A：BALB/c小鼠組；B：免疫抑制BALB/c小鼠組；C：SCID小鼠組；D：NOD－SCID小鼠組Fig.3 Blood smear of different mice groups infected with Babesia microtiA：BALB/c mice；B：BALB/c mice of immune suppression；C：SCID mice；D：NOD－SCID mice

另外，由巴貝蟲感染不同小鼠血涂片可以看到，大量蟲體侵染紅細(xì)胞，蟲體的生長、裂殖導(dǎo)致紅細(xì)胞大量溶血，引起小鼠溶血性貧血，且尿成黃色。在未處理和免疫抑制BALB/c小鼠體內(nèi)，雖染蟲率高峰時段也可達到82.4%和73.2%，且出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，但7～10 d后，由于免疫系統(tǒng)的作用，蟲體最終會下降至0%～2%的較低水平，且以后染蟲率不會再升高。而缺乏免疫系統(tǒng)的NOD/SCID小鼠組，蟲體可在其體內(nèi)反復(fù)增值，裂解紅細(xì)胞。這說明小鼠的免疫系統(tǒng)起到關(guān)鍵的作用，免疫系統(tǒng)健全的個體，就可以通過自身免疫系統(tǒng)的清除作用，將蟲體大量清除以使其處于很低的水平，但卻成為一個隱性帶蟲者，這在輸血時會造成很大的危害，在美國等國家已經(jīng)受到重視［14－15］；而免疫系統(tǒng)低下或切脾等免疫系統(tǒng)不健全者，則像SCID小鼠和NOD/SCID小鼠一樣存在很大的風(fēng)險［16］。

本次研究獲得了微小巴貝蟲在BALB/c小鼠、SCID小鼠和NOD/SCID小鼠體內(nèi)動態(tài)變化的規(guī)律；通過免疫抑制BALB/c小鼠充分說明了免疫系統(tǒng)對小鼠體內(nèi)清除微小巴貝蟲的重要作用；且初步建立了巴貝蟲感染SCID小鼠、NOD/SCID小鼠的免疫缺陷模型，為進一步開展巴貝蟲感染宿主免疫因子及免疫細(xì)胞在清除微小巴貝蟲時的作用打下了堅實的理論和實驗基礎(chǔ)。

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