韓新鋒，劉書亮，2，陳 荀，侯小剛，周 康，吳聰明

2.農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程四川省重點實驗室，雅安625014；

3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193

空腸彎曲桿菌（Campylobacterjejuni，C.jejuni）是一種人獸共患病原菌，也是一種主要的食源性感染病原菌，廣泛存在于各種動物體內(nèi)，尤以家禽、家畜和野禽帶菌最多，主要通過動物、食物、水等途徑傳播，可引起急性、自限性胃腸炎，嚴(yán)重的可導(dǎo)致格林－巴利綜合征、急性神經(jīng)肌肉癱瘓及反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等疾病。有研究報道空腸彎曲桿菌的感染率超過了沙門氏菌、志賀氏菌和大腸桿菌O157∶H7［1－2］，被認(rèn)為是引起全世界人類細(xì)菌性腹瀉的主要原因。在發(fā)展中國家，空腸彎曲桿菌是嬰幼兒感染性腹瀉最多見的病原菌。在我國，空腸彎曲桿菌也是主要的腹瀉病原菌之一［3］。

國內(nèi)對空腸彎曲桿菌的研究主要集中在病原分離鑒定以及快速檢測方面。隨著各種抗菌藥物在集約化養(yǎng)殖過程的廣泛使用，空腸彎曲桿菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，耐藥譜不斷擴(kuò)大，有關(guān)空腸彎曲桿菌的耐藥性成為研究熱點。耐藥性空腸彎曲桿菌可以通過受污染的食品進(jìn)入人體，此外，耐藥性還可以轉(zhuǎn)移給人體內(nèi)其它細(xì)菌，使得空腸彎曲桿菌的感染難以控制，直接威脅人類健康。對空腸彎曲桿菌耐藥性的研究多局限于表型方面，少數(shù)研究深入到基因水平。而關(guān)于食品生產(chǎn)鏈（養(yǎng)殖場－屠宰場－超市和市場）中空腸彎曲桿菌的分布情況、耐藥性及傳播情況的研究尚未見報道。

本研究旨在分析雞肉生產(chǎn)鏈中空腸彎曲桿菌分離株的耐藥性情況，為養(yǎng)殖環(huán)節(jié)和相關(guān)機(jī)構(gòu)制定抗菌藥管理政策和措施以及空腸彎曲桿菌的耐藥性安全評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 參照 GB/T 4789.9－2008方法，從四川省成都市、雅安市養(yǎng)雞場糞樣、屠宰加工廠雞糞樣和雞肉樣、市場抽取的雞肉樣共519份樣品中分離鑒定出空腸彎曲桿菌（C.jejuni）180株。空腸彎曲桿菌（C.jejuni）ATCC33560、大腸桿菌（E.coli）ATCC25922、金黃色葡萄球菌（S.aureus）ATCC29215、沙門氏菌（Salmonella）H 9812作為參考菌株，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基；M－H培養(yǎng)基和布氏肉湯臨用前加入5%牛血清。

1.1.3 試劑 Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、10×PCR buff－er、25 mmol/L MgCl2、d NTP mixture（各2.5 mmol/L）、引物、Gold View核酸染料、DNA Marker DL2000均購自寶生物工程（大連）有限公司。紅四氮唑（TTC）購自上海靈錦精細(xì)化工有限公司。其他均為常規(guī)化學(xué)試劑。

1.1.4 藥物 硫酸紅霉素（ERY），購自河南保利平原藥業(yè)有限責(zé)任公司；鹽酸環(huán)丙沙星（CIP）、左氟沙星（LEV）購自浙江新華制藥有限公司；硫酸慶大霉素（GEN），購自邯鄲滏榮制藥有限公司；氟苯尼考（FLO），購自寧夏太平洋生物制藥有限公司；硫酸鏈霉素（STR）、鹽酸克林霉素（CLI），鹽酸四環(huán)素（TET），由課題組統(tǒng)一提供。

1.1.5 主要儀器 SW－CJ－1F潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），3111二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo），MyCycler PCR儀（Bio－Rad），PowerPac Basic電 泳儀及水平電泳槽（Bio－Rad），凝膠成像系統(tǒng)（Bio－Rad）等。1.2 方法

1.2.1 藥液的配制 按照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)［4］進(jìn)行藥液配制，將藥物制成濃度為5 120μg/m L的儲藏液，－20℃保存，使用時將儲藏液稀釋為512μg/m L的應(yīng)用液。

1.2.2 藥敏盒的制備 向無菌96孔板各孔中加入100μL含10%新生牛血清的M－H肉湯液，然后向第1孔中加入抗菌藥物應(yīng)用液100μL，按二倍系列稀釋法稀釋，制成微量稀釋藥敏盒。做好的藥敏盒如不立即使用，需在4℃存放。

1.2.3 藥敏試驗 根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行［4］。挑取純培養(yǎng)的單個菌落接種到M－H肉湯，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，42℃微需氧環(huán)境培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)的菌液稀釋至0.5麥?zhǔn)媳葷峁埽?.2 mL 0.25%BaCl2和9.8 m L 1%H2SO4）后，再用 M－H肉湯稀釋至菌液含量為1×106CFU/m L。向制備好的藥敏盒各孔中加入稀釋菌液100μL，37℃微需氧條件下培養(yǎng)48 h。加0.5%的TTC試劑1～2滴，繼續(xù)培養(yǎng)30 min后觀察結(jié)果，記錄對各種藥物的最低抑菌濃度值（MIC）。以空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 33560為質(zhì)控菌株。

參考CLSI（2010）和文獻(xiàn)［5－6］，空腸彎曲桿菌分離株對某種抗菌藥物的MIC值不低于表1中標(biāo)準(zhǔn)的判定為菌株對該藥物耐藥。

1.2.4 MAMA PCR引物設(shè)計 以空腸彎曲桿菌DNA促旋酶（gyrA）基因的喹諾酮類耐藥決定區(qū)（QRDR）作為靶序列，根據(jù)Zirnstein［7］等設(shè)計的引物略做改進(jìn)。引物序列如下：P1 5′－TTT TTA GCA AAG ATT CTG AT－3′，P2 5′－CAA AGC ATC ATA AAC TGC AA－3′，P3 5′－CAG TAT AAC GCA TCG CAG－3′。其中P1、P3為保守引物，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為368 bp；P2為檢測突變位點的錯配引物，如P2 3′末端結(jié)合的模板DNA堿基發(fā)生點突變，則P1和P2預(yù)期擴(kuò)增片段大小為265 bp，如未發(fā)生突變，則不能擴(kuò)增出該條帶。

表1 空腸彎曲桿菌的藥敏試驗?zāi)退幣卸?biāo)準(zhǔn)Tab.1 Resistance breakpoints applied for the interpretation of susceptibility test of C.jejuni

1.2.5 DNA模板的制備 挑取哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上的純培養(yǎng)物于布氏肉湯中培養(yǎng)48 h，取1.5 m L培養(yǎng)液于2 m L EP管中，12 000 r/min常溫離心2 min，棄上清液。向其中加入800μL p H8.0 TE，12 000 r/min常溫離心1 min，去上清。重復(fù)一次上述離心步驟后，用80μL TE重懸沉淀，放入100℃沸水中煮沸10 min。取出置于冰水浴中冷卻5 min后，12 000 r/min離心3 min，上清液置于－20℃保存?zhèn)溆谩?.2.6 PCR擴(kuò)增 通過預(yù)試驗優(yōu)化PCR體系配比和循環(huán)參數(shù)后，PCR反應(yīng)體系確定為：10×PCR buffer 5μL，MgCl24μL，d NTPs 4μL，模板DNA 2μL，引物P1 0.8μL、P2 0.4 μL、P3 0.4μL、Taq酶1μL，補(bǔ)水至50μL。循環(huán)參數(shù)設(shè)定為：94℃，5 min；94℃，30 s，49℃，30 s，72℃，30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.7 PCR產(chǎn)物電泳分析 用0.5×TBE配制1.5%的瓊脂糖凝膠，加熱溶解、凝固后，放入電泳緩沖液中，取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1μL上樣緩沖液混勻，點樣于瓊脂糖凝膠孔中。電泳參數(shù)：電壓100 V，時間50 min。凝膠成像系統(tǒng)拍照、分析電泳結(jié)果。

1.2.8 序列測定 隨機(jī)取兩株突變菌株和兩株非突變菌的MAMA PCR產(chǎn)物送至寶生物工程（大連）有限公司測序。

2 結(jié) 果

2.1 耐藥性分析 藥敏試驗結(jié)果見表2，在受試的8種藥物中，空腸彎曲桿菌分離株對喹諾酮類藥物的耐藥率最高，對環(huán)丙沙星和左氟沙星的耐藥率分別為94.44%和93.89%；對四環(huán)素的耐藥率次之，為 91.67%；對 克 林 霉 素 （78.33%）、紅 霉 素（20.00%）、鏈霉素（20.56%）、慶大霉素（17.78%）、氟苯尼考（12.22%）呈現(xiàn)不同的耐藥率；雞肉生產(chǎn)鏈每個環(huán)節(jié)的空腸彎曲桿菌分離株均表現(xiàn)出多重耐藥性。

在養(yǎng)殖場中空腸彎曲桿菌對環(huán)丙沙星和左氟沙星的耐藥率都為100%，對紅霉素、慶大霉素和氟苯尼考非常敏感，耐藥率為0%；在屠宰場中，空腸彎曲桿菌對四環(huán)素和克林霉素的耐藥率高于對環(huán)丙沙星和左氟沙星的耐藥率，對鏈霉素和氟苯尼考較敏感；從養(yǎng)殖場到屠宰場，空腸彎曲桿菌對紅霉素、克林霉素、鏈霉素、慶大霉素、四環(huán)素和氟苯尼考的耐藥率明顯升高。在市場中空腸彎曲桿菌對環(huán)丙沙星和左氟沙星的耐藥率均為100%，對慶大霉素的耐藥率為0%；從屠宰場到市場，空腸彎曲桿菌對紅霉素、鏈霉素、慶大霉素和四環(huán)素的耐藥率顯著降低，對克林霉素、環(huán)丙沙星和左氟沙星的耐藥率呈升高趨勢。可以看出屠宰場空腸彎曲桿菌的耐藥率相對養(yǎng)殖場和市場中空腸彎曲桿菌的耐藥率高，總體來講，從養(yǎng)殖場到市場空腸彎曲桿菌對上述8種藥物的耐藥率呈持平或上升趨勢。

2.2 耐藥譜 180株空腸彎曲桿菌對8種藥物共產(chǎn)生了15種耐藥譜，所有菌株至少耐2種藥物（表3），多重耐藥菌株（耐3種及以上藥物）占91.67%。藥敏試驗結(jié)果顯示優(yōu)勢耐藥譜（CLI CIP LEV TET）明顯，占33.33%；對CIP、LEV和 TET同時耐藥的菌株占20%。肉雞養(yǎng)殖場、屠宰場和市場中空腸彎曲桿菌的耐藥譜分別為6種、13種和5種。雞肉生產(chǎn)的3個環(huán)節(jié)具有相同的優(yōu)勢耐藥譜（CLI CIP LEV TET），在養(yǎng)殖場、屠宰場和市場中分別占30.77%、29.13%和68.00%。在雞肉生產(chǎn)的3個環(huán)節(jié)中同時都有耐藥譜為CLI CIP LEV TET和CIP LEV TET的空腸彎曲桿菌，表明耐藥性空腸彎曲桿菌在雞肉生產(chǎn)鏈中可能存在水平傳播趨勢。2.3 耐喹諾酮類藥物基因的MAMA PCR檢測

根據(jù)MAMA PCR的原理［7］可知，發(fā)生突變的菌株能擴(kuò)增出兩條帶，而沒有發(fā)生突變的菌株只能擴(kuò)增出一條帶。本研究利用MAMA PCR技術(shù)，檢測了137株耐環(huán)丙沙星空腸彎曲桿菌的gyrA基因第257位突變情況，結(jié)果有131株空腸彎曲桿菌檢測結(jié)果陽性，擴(kuò)增出了兩條特異性片段，占所檢測環(huán)丙沙星耐藥菌株的95.62%（圖1）。10株環(huán)丙沙星敏感菌株均沒有在該位置檢測出點突變，只能擴(kuò)增出一條帶。

2.4gyrA基因耐藥決定區(qū)測序結(jié)果 空腸彎曲桿菌gyrA基因耐藥決定區(qū)（第61位～360位堿基）測序結(jié)果見表4。測序結(jié)果表明，環(huán)丙沙星耐藥菌株MJF31和MJF53都在第257位堿基發(fā)生了ACA→ATA（Thr－86→Ile）的突變，而環(huán)丙沙星敏感菌株JF9和JF13均未發(fā)生ACA→ATA（Thr－86→Ile）的突變。該結(jié)果充分說明了MAMA PCR檢測喹諾酮類耐藥基因點突變的準(zhǔn)確性。

表2 雞肉生產(chǎn)鏈中空腸彎曲桿菌分離株的耐藥率（%）Tab.2 Resistance rate of C.jejuni isolates from chicken production chain against 8 antimicrobial agents

表3 雞肉生產(chǎn)鏈中空腸彎曲桿菌耐藥譜Tab.3 Drug resistance profiles of C.jejuni isolates from chicken production chain

3 討 論

本研究中空腸彎曲桿菌對環(huán)丙沙星、左氟沙星和四環(huán)素的耐藥率較高，這與近年來我國大量使用喹諾酮類和四環(huán)素類藥物治療家禽的腹瀉等疾病有關(guān)，相比之下氟苯尼考、鏈霉素和慶大霉素藥物在家禽上使用較少，因此，對氟苯尼考、鏈霉素和慶大霉素較敏感，與姜峰［8］和許海燕等［9］的報道一致。Luangtongkum等研究表明空腸彎曲桿菌對紅霉素的耐藥率為80%［10］，Jain等報道空腸彎曲桿菌對四環(huán)素的耐藥率僅為26.5%［11］，與本研究的耐藥性試驗結(jié)果差異較大，原因可能是不同地區(qū)治療動物疾病或在飼料中添加的抗生素的種類和用量標(biāo)準(zhǔn)不同，從而導(dǎo)致空腸彎曲桿菌的耐藥性有所差異。空腸彎曲桿菌對各種抗菌藥物的耐藥性在雞肉生產(chǎn)鏈條中存在差異，從養(yǎng)殖場到市場，空腸彎曲桿菌對上述8種抗菌藥物的耐藥率呈持平或上升趨勢，可能是由于這些藥物的耐受菌株在相同條件處理時易存活下來或是加工過程中再污染所致。雞肉生產(chǎn)鏈3個環(huán)節(jié)的空腸彎曲桿菌分離株多重耐藥性突出，耐3種或3種以上藥物的菌株所占比例為91.67%，明顯高于國外報道［12］。這可能與國內(nèi)養(yǎng)殖和臨床用藥過程菌株受到的選擇壓力有關(guān)?？漳c彎曲桿菌分離株表現(xiàn)出較高的多重耐藥率，給空腸彎曲桿菌感染的治療帶來了困難，應(yīng)長期對養(yǎng)殖場和食品源空腸彎曲桿菌的耐藥性進(jìn)行監(jiān)測，了解其變化趨勢，為食品源空腸彎曲桿菌的安全評價提供數(shù)據(jù)支持。

表4 空腸彎曲桿菌分離株gyr A基因耐藥決定區(qū)測序結(jié)果比較Tab.4 Comparison on QRDR DNA sequences of C.jejuni gyr A gene

喹諾酮類藥物是治療空腸彎曲桿菌腸炎的首選藥物，但由于該類藥物在食品動物中的大量使用，使得動物性食品鏈中空腸彎曲桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性不斷增強(qiáng)?？漳c彎曲桿菌gryA基因內(nèi)喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDR）產(chǎn)生的DNA突變，是導(dǎo)致喹諾酮類藥物耐藥的主要原因［7，13－14］，其中g(shù)yrA 基因第257位堿基發(fā)生C→T突變，導(dǎo)致該位置三聯(lián)密碼子編碼的86位氨基酸發(fā)生蘇氨酸→異亮氨酸（Thr－86→Ile）突變，此種點突變引起的耐藥水平最高，是空腸彎曲桿菌對喹諾酮類藥物耐藥的主要原因之一，可以導(dǎo)致DNA促旋酶結(jié)構(gòu)的改變，從而引起酶空間結(jié)構(gòu)障礙，阻止喹諾酮類藥物進(jìn)入喹諾酮作用區(qū)域，或由于無力化學(xué)變化干擾喹諾酮類藥物—酶—DNA間相互作用，從而產(chǎn)生耐藥性。

MAMA PCR最首要的一步是根據(jù)已知的突變位點設(shè)計合適的引物，其次就是PCR循環(huán)條件的優(yōu)化，最后通過電泳觀察即可判斷結(jié)果［7］。Said等［15］采用MAMA PCR檢測對喹諾酮類藥物耐藥的空腸彎曲桿菌，結(jié)果表明對萘啶酸和環(huán)丙沙星耐藥的89株菌均在gyrA基因第257位發(fā)生了突變，其余對環(huán)丙沙星和萘啶酸敏感的菌株均沒有在該點檢測到突變。Sonnevend等［16］利用 MAMA PCR技術(shù)對彎曲桿菌的gyrA基因進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)35株對環(huán)丙沙星耐藥的菌株均在gyrA基因發(fā)生了Thr－86→Ile突變。姜毅等［17］利用MAMA PCR技術(shù)對15株環(huán)丙沙星耐藥空腸彎曲桿菌均檢測出在gyrA基因第257位發(fā)生點突變，其余對喹諾酮藥物敏感的菌株均沒有檢測出此突變。上述MAMA PCR檢測結(jié)果與耐藥表型完全一致。本研究利用MAMA PCR檢測了137株對環(huán)丙沙星耐藥的空腸彎曲桿菌gyrA基因第257位點突變的情況，檢出有131株空腸彎曲桿菌在該位置發(fā)生了點突變，占環(huán)丙沙星耐藥菌株的95.62%。其它表型耐藥而MAMA PCR檢測結(jié)果陰性的菌株，原因可能是部分空腸彎曲桿菌在其它突變位點發(fā)生了突變引起的耐藥，或者是細(xì)菌的外排泵作用導(dǎo)致了耐藥性的產(chǎn)生。

圖1 部分空腸彎曲桿菌分離株gyr A基因MAMA PCR檢測電泳圖M：DL2000 DNA Marker；C：空 腸 彎 曲 桿 菌ATCC33560；1－56：分離自雞肉生產(chǎn)鏈的環(huán)丙沙星耐藥空腸彎曲桿菌Fig.1 Electrophoresis results for the MAMA PCR products of Campylobacter jejuni isolates from chicken production chainM：DNA Marker DL2000；C：C.jejuni ATCC33560；Lane 1－56：Ciprofloxacin－resistant C.jejuni isolates from chicken production chain

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