劉 蕓，張 潔，王 博，田 疆，毛玲玲，孫英偉，王子江，孫婷婷，姚文清，趙 卓

病毒性出血熱是一種臨床癥狀表現(xiàn)為急性發(fā)熱和出血的疾病，病原體為人獸共患及節(jié)肢動(dòng)物攜帶傳播的RNA病毒。目前在我省最常見的出血熱病毒應(yīng)屬布尼亞科病毒。有致腎綜合征出血熱的漢坦病毒［1－2］和布尼亞病毒［3］。2011年6－8月我省大連地區(qū)的農(nóng)民相繼出現(xiàn)不明原因出血樣癥狀 ，一名“蜱咬”患者因疑似腎綜合征出血熱而就診于大連市第六人民醫(yī)院，我們對(duì)其展開了流行病學(xué)調(diào)查及實(shí)驗(yàn)室病原體檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 樣本

1.1.1 血液樣本 據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果，采集“蜱咬”患者急性期血液樣本及同居住地的26份非患者血清樣本。

1.1.2 蜱蟲樣本 該患者有蜱蟲叮咬史，入院后在其腋下發(fā)現(xiàn)叮咬蜱蟲一只。2011年8月又采集了“蜱咬”患者所在地及相鄰村莊路邊草叢及牛、犬體表叮咬的長(zhǎng)角血蜱蟲94只，分成19組，放入不同瓶中標(biāo)記。

1.2 核酸的提取及檢測(cè) 采用QIAGEN公司提供的EZ1 Virus Mini Kit V2.0試劑盒提取RNA，詳細(xì)操作步驟按說明書要求進(jìn)行。采用Real－Time PCR方法檢測(cè)SFTSV核酸。核酸檢測(cè)試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因公司提供。

1.3 血清學(xué)檢測(cè) 采用ELISA方法對(duì)“蜱咬”患者急性期血清樣本進(jìn)行SFTSV的Ig M抗體檢測(cè)；對(duì)同居住地的26份非患者血清樣本進(jìn)行SFTSV的IgG抗體檢測(cè)。試劑盒由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司提供。

1.4 病毒分離 將VERO－E6細(xì)胞培養(yǎng)至單層（VERO－E6細(xì)胞由中國疾病預(yù)防控制中心病毒所，以下簡(jiǎn)稱“病毒所”提供。）接種“蜱咬”患者血清、叮咬的蜱懸液以及19組蜱蟲研磨懸液0.3 mL，吸附2 h后換維持液，盲傳3代，觀察細(xì)胞病變（CPE）。新布尼亞病毒致VERO－E6細(xì)胞病變特點(diǎn)為細(xì)胞被感染9～12 d后出現(xiàn)脫落、溶解變形，呈柳葉狀病變出現(xiàn)緩慢但維持時(shí)間長(zhǎng)［4］。刮取少量細(xì)胞懸液滴入凹孔玻片吹干后冷丙酮固定，并用間接免疫熒光法（IFA）檢測(cè)病毒抗原。

1.5 病毒滴度測(cè)定 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VERO－E6細(xì)胞接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用Hanks液將分離的病毒倍比稀釋為10－1～10－1212個(gè)濃度的病毒液，每孔接種病毒液100 μL，平行4孔，吸附2 h后棄Hanks液，補(bǔ)加 MEM維持液300μL，5%CO2、37℃培養(yǎng)15 d觀察細(xì)胞病變。Karber法計(jì)算TCID50。

1.6 病毒鑒定 采用7對(duì)SFTSV的M片段全基因測(cè)序引物對(duì)分離到的毒株進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。SFTSV的M片段的RT－PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件全部由病毒所提供。

2 結(jié) 果

2.1 血清學(xué)檢測(cè) “蜱咬”患者急性期血清樣本SFTSV的Ig M抗體陽性、IgG抗體陰性；26份非患者血清樣本中4份SFTSV的IgG抗體陽性。

2.2 核酸檢測(cè) “蜱咬”患者血液樣本及其叮咬的蜱蟲SFTSV核酸陽性，采集的94份長(zhǎng)角血蜱樣本SFTSV核酸均為陰性。

2.3 病毒分離及滴度測(cè)定 牛、羊、犬體表叮咬的蜱蟲懸液細(xì)胞培養(yǎng)均為陰性?！膀缫А被颊哐杭捌涠ＲУ尿缦x經(jīng)VERO－E6細(xì)胞培養(yǎng)后均獲得陽性分離株。分別被命名為：LNDL－2011－XQ（遼寧大連－2011年－血清分離株），LNDL－2011－PC（遼寧大連－2011 年－蜱 蟲 分 離 株 ）。 對(duì) LNDL－2011－XQ 株、LNDL－2011－PC株及我省撫順和丹東的分離株同時(shí)進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，結(jié)果大連分離株滴度為10－6，其他地區(qū)為10－5。

2.4 系統(tǒng)發(fā)生分析RT－PCR產(chǎn)物用QIAGEN膠純化試劑盒（QIA quick Gel Extraction K it）純化，操作按試劑盒說明書。純化后產(chǎn)物送上海英維捷基（Invitrogen）貿(mào)易有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果的比對(duì)及相似性分析使用軟件Bioedit；同源性分析以及進(jìn)化樹的構(gòu)建通過MEGA4完成。用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的SFTSV病毒各基因型代表株的參比序列來自NCB I的GenBank。見圖1。

圖1 新布尼亞病毒分離株M基因遺傳進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic tree of M gene in SFTSV strains

3 討 論

患者臨床癥狀、體征及血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示為新布尼亞病毒感染者。雖然其家人或其他密切接觸者未發(fā)生感染。因病人血液中病毒含量較高，初代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的病變，不排除有人傳人的可能性。健康人群調(diào)查表明：有隱性感染者存在，因樣本量太少目前還不能確定正常人群自然感染后抗體的保護(hù)水平。有待于在今后的監(jiān)測(cè)工作中進(jìn)一步完善。

傳播媒介的調(diào)查結(jié)果顯示，在患者居住的村莊及周邊山村小路采集的野外長(zhǎng)角血蜱與動(dòng)物體表叮咬的蜱蟲均未檢測(cè)到SFTSV抗原，可能與樣本量少有關(guān)。但患者體表叮咬的蜱新布尼亞病毒分離成功，這一結(jié)果將進(jìn)一步提示，該病可能為一種由蜱傳播的自然疫源性疾?。?－6］。

表1 患者和蜱蟲病毒分離株M基因核苷酸與其他新布尼亞病毒分離株同源性比較Tab.1 Homology comparison on partial nucleotide sequence of SFTSV M gene from patient and tick to other strains（%）

SFTSV屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，為分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，病毒顆粒呈球形，直徑80－100nm，病毒基因組分為L(zhǎng)、M、S 3個(gè)片段［7］。系統(tǒng)發(fā)生分析表明：大連地區(qū)SFTSV分離株（LDL2011－PC，LDL2011－XQ及LDL2011－15）與國際標(biāo)準(zhǔn)的白蛉病毒株序列親緣性較近但存在著明顯的不同種的現(xiàn)象，且存在著明顯的地域聚集特點(diǎn)，區(qū)別于我省丹東分離株；其次，抗原滴度測(cè)定表明大連分離株較其它地區(qū)分離株滴度高毒力強(qiáng)。從患者體表叮咬的蜱蟲分離株與該患者血清分離株M片段堿基序列做比對(duì)同源性達(dá)99.7%，說明該患者的發(fā)病與其叮咬的蜱蟲自身攜帶的病毒有密切關(guān)系。大連地區(qū)分離株與遼寧2號(hào)株（LN2：遼寧撫順株）、丹東株（LDD2011－1）及河南6號(hào)株遺傳距離較近。

試驗(yàn)與調(diào)查結(jié)果顯示：即我省丹東、撫順、鐵嶺地區(qū)自2009起因獲得SFTSV分離株被確定為疫區(qū)外，大連地區(qū)亦成為新布尼亞病毒存在的疫源地。

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