姚 娜，陳創(chuàng)夫，于 強(qiáng)，張麗娟

2.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所無形體室，北京 102206

嗜吞噬細(xì)胞無形體屬于立克次體目無形體科無形體屬，是一類經(jīng)蜱傳播的嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌，主要引起人粒細(xì)胞無形體病（HGA）。20世紀(jì)90年代初美國首次發(fā)現(xiàn)以來，澳洲、歐洲多國、韓國及我國先后均有報(bào)道，且近年呈上升趨勢［1－3］。天津及山東沂源縣調(diào)查結(jié)果顯示當(dāng)?shù)厝巳喝肆＜?xì)胞無形體IgG抗體陽性率分別為8.8%和26.7%［4－5］。2006年安徽蕪湖弋磯山醫(yī)院人粒細(xì)胞無形體院內(nèi)傳播感染事件是中國第一次報(bào)道的人粒細(xì)胞無形體感染確診病例，也是世界范圍內(nèi)首次報(bào)告的人粒細(xì)胞無形體人傳人事件［6］。

目前認(rèn)為該病原的重要致病效應(yīng)子是嗜吞噬細(xì)胞無形體Ank A蛋白，該蛋白經(jīng)Ⅳ型分泌系統(tǒng)分泌，特異的結(jié)合宿主核DNA和DNA結(jié)合蛋白，影響和改變宿主細(xì)胞一些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能，從而抑制宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答［7－9］，如Ank A與宿主染色質(zhì)調(diào)控結(jié)構(gòu)域的相互作用引起CYBB/gp91pbox基因表達(dá)下調(diào)，而這兩個(gè)基因編碼吞噬細(xì)胞氧化酶復(fù)合物的一個(gè)重要組分［10］，由此，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞一系列功能如脫顆粒、呼吸爆破、趨化游走及氧化殺傷病原微生物能力喪失等。最新研究證實(shí)ank A基因的變異性決定宿主易感性［11］，即人源、動(dòng)物源及不同種類動(dòng)物分離株ank A基因表現(xiàn)遺傳異質(zhì)性。為探索人源無形體不同分離株Ank A蛋白免疫原性差異，進(jìn)一步揭示因結(jié)構(gòu)及免疫表位差異導(dǎo)致與宿主細(xì)胞作用差異，我們對(duì)3株無形體不同ank A基因進(jìn)行了原核表達(dá)及免疫原性初步分析。

1 材 料

1.1 菌株和對(duì)照血清 3株嗜吞噬細(xì)胞無形體人分離株DNA（Webster株，斯洛文尼亞1 567株，美國96HE58株）為美國Johns Hopkins大學(xué)醫(yī)學(xué)院JS.Dumler實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，HGA病人血清為本室2009－2010年臨床收集的經(jīng)病原學(xué)（4例）、分子生物學(xué)（5例）及血清學(xué)診斷病例（10例）混合血清。正常人血清為本室工作人員混合血清。

1.2 載體E.coliDH5α和BL21（DE3）為本實(shí)驗(yàn)室保存，表達(dá)質(zhì)粒p ET30a（＋）購自Novagen公司。1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Balb/c小鼠，雄性，體重（18～22 g），由北京海淀區(qū)興隆實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖場提供，許可證號(hào)：SCXK－（軍）2007－004。Balb/c小鼠飼養(yǎng)在中國CDC動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室。由獲得動(dòng)物飼養(yǎng)資質(zhì)的管理人員飼養(yǎng)。

1.4 主要試劑 DNA提取試劑盒購自德國QIAGEN公司；EcoRⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶購自大連寶生物有限公司；DNA和蛋白Marker購自天根生物有限公司；質(zhì)粒提取和PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記羊抗人、羊抗鼠IgG（H＋L）購自北京昌盛鼎國公司；Ni－NTA His－Bind Resin，色譜柱購自Novogen公司。

1.5 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀為MJ Research PTC－100 Peltier thermal cycler；蛋白測量儀為BIO－RAD公司SmartSpecTM3000；質(zhì)譜分析儀為美國ABI公司4700 proteomics analyzer；酶標(biāo)儀為美國伯騰公司BIO－Te K Elx50TM酶標(biāo)儀。PAGE電泳及western blot轉(zhuǎn)印儀分別為BIO－RAD公司 Mini－PROTEAN4和170－3930Mini Trans－Blot C。

2 方 法

2.1 Ank A蛋白生物信息學(xué)分析及預(yù)測 從Gen－Bank（http：//www.ncbi.nlm.nihgov/）中下載3條嗜吞噬細(xì)胞無形體分離株Ank A蛋白序列，包括Webster株（GU236811.1），1 567株（GU236801.1）和96 HE58株（GU236808.1），用 MEGA5.0軟件分析序列一致性和保守區(qū)，利用DNASTAR綜合序列分析軟件中的Protean模塊預(yù)測分析B細(xì)胞抗原表位，采用 Kyte－Doolittle親水性方案、Karplus－Schulz柔韌性方案、Emini表面可及性方案、Jameson－Wolf抗原指數(shù)方案和Chou－Fasman二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測方案綜合預(yù)測。

2.2 引物設(shè)計(jì)和基因擴(kuò)增 經(jīng)過上述生物信息學(xué)分析后選擇保守區(qū)，用Primer premer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列及相對(duì)位置如下：Ank A－F引物5′－ATGAATTCATGCTGCCGCCTGAAAGTCC－3′（核酸序列2701－2720（Webster）、2704－2723（1 567株）、2704－2723（96 HE58株），下劃線為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），Ank A－S引物5′－CCGCTCGAGCTATTT GTCTTTGGTAG－3′（核酸序列 3464－3480（Webster）、3440－3456（1 567 株）、3467－3483（96HE58株），下劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn)），以上述3株無形體人分離株基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增ank A基因。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性50 s，56℃退火50 s，72℃延伸1 min，共40循環(huán)；72℃再延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 PCR產(chǎn)物純化后及p ET－30a載體經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，卡那霉素抗性篩選陽性重組子，提取重組質(zhì)粒PCR鑒定，陽性質(zhì)粒送北京擎科生物公司測序。

2.4 蛋白表達(dá)和純化 重組質(zhì)粒pET－30a－Anka轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3），終濃度 0.5 mmol/L IPTG 37℃誘導(dǎo)6 h，離心收集誘導(dǎo)產(chǎn)物的上清和沉淀，PAGE電泳鑒定目的蛋白的表達(dá)形式。陽性重組菌經(jīng)大量誘導(dǎo)并收集上清，經(jīng)鎳柱純化，使用咪唑洗脫目的蛋白。BCA法測定重組蛋白濃度。

2.5 重組蛋白飛行質(zhì)譜分析 將純化蛋白送至中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所診斷室進(jìn)行蛋白飛行質(zhì)譜分析。

2.6 重組蛋白免疫原性檢測

2.6.1 小鼠免疫 將小鼠隨機(jī)分為3組，每組5只，3只免疫，2只對(duì)照，將純化的重組蛋白與弗氏完全佐劑等體積混合，以100μg/只的抗原劑量經(jīng)背部皮內(nèi)多點(diǎn)免疫小鼠，初次免疫后第14和28 d，分別將重組蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混合和不含佐劑重組蛋白，以50μg/只加強(qiáng)免疫；對(duì)照組以生理鹽水代替重組蛋白，第3次免疫10 d后經(jīng)心臟采血，分離血清。

2.6.2 免疫抗體水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（間接ELISA）檢測免疫鼠抗體水平。簡述為：純化重組蛋白1.5μg/孔包被酶標(biāo)板，常規(guī)ELISA法檢測每組小鼠免疫后混合血清中抗Ank A IgG抗體的幾何平均滴度。

2.6.3 免疫原性分析 3株嗜吞噬細(xì)胞無形體人分離株Ank A重組蛋白分別經(jīng)12%SDS－PAGE轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，膜與免疫鼠血清（1∶400、1600）、我國人 HGA陽性血清（1∶20、40、80）4℃作用過夜，與辣根過氧化物酶標(biāo)羊抗鼠、羊抗人IgG（H＋L）按1∶10 000稀釋后反應(yīng)1 h，DAB顯色。

3 結(jié) 果

3.1 免疫原表位預(yù)測 Ank A蛋白B淋巴細(xì)胞抗原表位預(yù)測分析結(jié)果見圖1。我們選取轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲；親水性部位；抗原指數(shù)及表面可及性分值高部位，同時(shí)3條序列差異性較大片段。Webster株選取核酸序列2701－3480、1 567株選取2704－3456、96HE58株選取2704－3483為引物設(shè)計(jì)區(qū)域。為進(jìn)一步了解3株菌Ank A原核表達(dá)片段抗原表位的異同，用 IEDB 中 Protean （http：//tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb＿input）預(yù) 測 分 析Ank A克隆表達(dá)片段B細(xì)胞線性表位（圖2）。

圖1 3株嗜吞噬細(xì)胞無形體Ank A蛋白B淋巴細(xì)胞抗原表位預(yù)測分析結(jié)果A：Webster株、B：1 567株，C：96 HE58株Fig.1 B lymphocyte epitope prediction of Ank A protein from 3 isolates of A.phagocytophilum by ProteanA：Webster strain；B：1 567 strain；C：96 HE58 strain

3.2 PCR及重組表達(dá)質(zhì)粒鑒定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定可見分別約780 bp（Webster株），750 bp（1 567株），780 bp（96 HE58株）特異性基因條帶，見圖3A。3株菌Ank A蛋白重組質(zhì)粒雙酶切鑒定見圖3B和3C。重組質(zhì)粒測序結(jié)果經(jīng)Blast序列比對(duì)分析，質(zhì)粒p ET30a（＋）－Ank A（Webster株）中ank A序列與GenBank中登錄的GU236811.1基因序列完全一致；質(zhì)粒p ET30a（＋）－Ank A（1 567株）中ank A序列與GenBank中登錄的GU236801.1基因序列完全一致。質(zhì)粒p ET30a（＋）－Ank A（96 HE58株）中Ank A序列與GenBank中登錄的GU236808.1基因序列完全一致。

3.3 重組蛋白表達(dá)與純化 重組質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS－PAGE分析，可見相對(duì)分子質(zhì)量約45 k Da的預(yù)期蛋白條帶，主要以可溶性形式存在，純化后的蛋白條帶單一（圖4）。

圖2 3株嗜吞噬細(xì)胞無形體Ank A蛋白B淋巴細(xì)胞線性表位預(yù)測分析結(jié)果A：Webster株、B：1 567株，C：96 HE58株Fig.2 B lymphocyte linear epitope prediction of Ank A protein from 3 isolates of A.phagocytophilum by ProteanA：Webster strain；B：1 567 strain；C：96HE58 strain

3.4 重組蛋白鑒定 純化蛋白飛行質(zhì)譜分析結(jié)果顯示酶解肽段均來自于嗜吞噬細(xì)胞無形體Ank A蛋白（圖5）。3種蛋白質(zhì)氨基酸序列與預(yù)期的Webster株、1 567株及96 HE58株均100%同源。

圖3 目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果（A）及重組質(zhì)粒pET30a（＋）－Ank A雙酶切鑒定（B和C）Fig.3 PCR amplification of target ank A gene（A）and identification of the recombinant plasmid by enzyme digestion（B and C）A—M：DNA marker DL2000；1－3：PCR production by using template of DNA （1：Webster strain；2：1 567 strain；3：96HE58 strain）；N：Negative control.B—M1：DNA marker DL2000；M2：DNA marker DL15000；1－2：Recombinant plasmids after enzyme digestion（1：Webster strain；2：1 567 strain）；3：Pre－digestion recombinant plasmids.C—M：DNA marker DL2000；1：Recombinant plasmids after enzyme digestion（96HE58 strain）.

3.5 小鼠免疫抗體水平 ELISA檢測3組小鼠免疫抗體水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，對(duì)照組小鼠免疫前后抗體水平無變化，而免疫小鼠免疫后抗體水平較免疫前顯著升高，其中Webster株平均抗體滴度達(dá)1∶25 600，1 567株抗體平均為1∶12 800，96HE58株平均為1∶25 600。

3.6 重組蛋白免疫原性分析 采用我國人粒細(xì)胞無形體病患者陽性血清與重組蛋白Western blot分析，結(jié)果顯示純化的Ank A重組蛋白可與人粒細(xì)胞無形體病患者陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)（圖6）。實(shí)驗(yàn)使用的病人混合血清采用美國FOCUS間接免疫熒光診斷試劑（抗原為美國本土分離株）檢測抗體效價(jià)為1∶80。本研究Webster株重組蛋白與HGA病人陽性血清反應(yīng)，效價(jià)為1∶80，1 567株重組蛋白效價(jià)1∶20反應(yīng)，96HE58株重組蛋白效價(jià)1∶80。

3.7 Ank A重組蛋白交叉免疫分析 由于用同一個(gè)引物擴(kuò)增出3株嗜吞噬細(xì)胞無形體Ank A蛋白的DNA片段，并對(duì)其核苷酸測序后分析發(fā)現(xiàn)3條序列存在差異性，并對(duì)這3條序列進(jìn)行B細(xì)胞線性表位預(yù)測分析（圖2）發(fā)現(xiàn)其抗原表位存在差異，因此對(duì)Ank A重組蛋白與小鼠免疫后血清進(jìn)行交叉Western blot反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果（圖7）顯示3株無形體Ank A蛋白鼠免疫多克隆抗體交叉免疫滴度無顯著差異，同時(shí)ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Western blot相同。

圖4 純化后重組蛋白SDS－PAGE凝膠電泳結(jié)果A：Webster株 ；B：1 567株；C：96HE58株Fig.4 SDS－PAGE analysis of the purified recombinant proteinM：Protein marker；1：Purified recombinant Ank A proteinA：Webster strain；B：1 567 strain；C：96HE58 strain

圖6 Ank A重組蛋白免疫印跡分析A：Webster株 ；B：1 567株；C：96HE58株Fig.6 Western blot analysis of recombinant Ank A proteinM：Protein marker；1：Recombinant protein recognition by HGA positive human sera（1∶20）；2：Recombinant protein recognition by HGA positive human sera（1∶40）；3：Recombinant protein recognition by HGA positive human sera（1∶80）；4：Recombinant protein after incubation with normal human sera（1∶20）.A：Webster strain；B：1 567 strain；C：96 HE58 strain

4 討 論

在嗜吞噬細(xì)胞無形體侵染宿主及致病過程中，Ank A蛋白是重要的效應(yīng)子。該蛋白嚴(yán)重干預(yù)宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答，對(duì)病原菌的入侵和胞內(nèi)復(fù)制起到關(guān)鍵作用。Ank A蛋白的遺傳異質(zhì)性與宿主侵染易感性以及臨床致病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。有研究認(rèn)為錨蛋白重復(fù)疊加形成L形結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用［12］。

本文通過原核基因工程技術(shù)克隆表達(dá)了3株來自歐美地區(qū)的嗜吞噬細(xì)胞無形體致病菌株Ank A蛋白，并在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中獲得高效表達(dá)，純化后經(jīng)飛行質(zhì)譜分析，表達(dá)的重組蛋白氨基酸序列與預(yù)期蛋白100%同源。通過免疫印跡分析，與我國自然感染的人粒細(xì)胞無形體病病人陽性血清具有良好圖5 重組蛋白飛行質(zhì)譜報(bào)告

A：Webster株；B：1 567株；C：96HE58株

Fig.5 Identification of the recombinant Ank A protein by mass spectrum analysis

A：Webster strain；B：1 567 strain；C：96 HE58 strain的免疫反應(yīng)。其抗原抗體Western blot反應(yīng)效價(jià)與美國FOCUS間接免疫熒光檢測效價(jià)基本一致。說明我們表達(dá)的重組蛋白具有良好的天然免疫原性。3株菌Ank A重組蛋白免疫Balb/c小鼠，均能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，并獲得較高抗體滴度，顯示3株重組蛋白具有良好的免疫原性。

圖7 3株Ank A重組蛋白免疫抗體交叉反應(yīng)A：Webster株 ；B：1 567株；C：96HE58株Fig.7 Western blot analysis with mouse sera immunized by recombinant Ank A proteinM：Protein marker；1：Mouse sera immunized with Webster strain recombinant Ank A protein（1∶400）；2：Mouse sera immunized with Webster strain recombinant Ank A protein（1∶1 600）；3：Mouse sera immunized with 1 567 strain recombinant Ank A protein （1∶400）；4：Mouse sera immunized with 1 567 strain recombinant Ank A protein（1∶1 600）；5：Mouse sera immunized with 96HE58 strain recombinant Ank A protein（1∶1 600）；6：Mouse sera immunized with 96HE58 strain recombinant Ank A protein 1∶1 600）；7：Pre－immunized mouse sera（1∶100）.A：Webster strain；B：1 567 strain；C：96 HE58 strain

氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)Webster株和96HE58株Ank A重組蛋白存在一個(gè)氨基酸不同，而與1 567株氨基酸序列差異較大，3株Ank A重組蛋白的一致性為91.6%。盡管如此，通過對(duì)3株嗜吞噬細(xì)胞無形體重組蛋白與免疫鼠血清多克隆抗體Western blot交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示存在明顯的交叉反應(yīng)，由此推測重組蛋白氨基酸一級(jí)序列上存在的差異并未對(duì)蛋白抗原性產(chǎn)生影響，不同株間重組蛋白與免疫小鼠血清均能發(fā)生反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)成功表達(dá)了3株嗜吞噬細(xì)胞無形體Ank A蛋白，通過免疫小鼠多克隆抗體交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，沒有檢測出3株嗜吞噬細(xì)胞無形體Ank A蛋白免疫原性間的差異。

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