李義剛，劉濱揚，彭穎，廖偉，武小燕，蘇甜，歐瑞康，聶湘平

暨南大學生命科學技術學院生態(tài)系水體富營養(yǎng)化與赤潮防治廣東普通高校重點實驗室，廣州510632

三氯生(2，4，4'-三氯-2'-羥基二苯醚，triclosan)是一種廣泛使用的廣譜抗菌劑，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母及病毒均有廣泛高效的殺滅及抑制作用。三氯生應用領域十分廣泛，包括醫(yī)藥、化妝品與洗滌劑等領域，目前已經開發(fā)出200余種日化產品及專業(yè)新產品［1］。伴隨著各種醫(yī)藥、化妝品及洗滌劑用品的廣泛使用，三氯生排放進入水體以及其他環(huán)境介質中，甚至還可能進入食物鏈，最后在植物、動物和人體中蓄積［2-3］。周世兵等［4］報道在污水處理廠排污口附近水域能普遍檢出三氯生。Peng等［5］報道在珠江水域中檢測出三氯生的含量在35～1 023 ng·L-1之間。Coogan等［6］在北德克薩斯州某河流的藻類中檢測到三氯生的富集含量達到50～400 ng·g-1(以鮮質量計);Adolfsson-Erici等［7］在人的奶汁中發(fā)現(xiàn)三氯生的質量濃度為0．07～300 ng·g-1(以鮮質量計)。三氯生作為藥品與個人護理品中的添加物，在低濃度的情況下，毒性并不顯著，因此尚未得到足夠重視［4］，但是在一定條件下，三氯生可生成其他有毒中間產物。Milagros等［8］發(fā)現(xiàn)水中的三氯生在紫外線照射的條件下，會光解生產2，7/2，8-二氯二苯并-對-二惡英。二惡英是一類強烈致癌物質，美國藥典對于三氯生中的二惡英含量規(guī)定不得大于 0．25mg·kg-1［9］。此外，三氯生可被自由氯離子氧化，生成氯仿、2，4，6-三氯苯酚等有毒化合物［10］。李林朋等［11］的研究表明，三氯生可導致人體正常干細胞的DNA斷裂損傷，且具有明顯的劑量-效應和時間-效應關系。Gee等［12］研究發(fā)現(xiàn)，三氯生可對人類乳腺癌細胞產生雌激素和雄激素效應。大量文獻表明三氯生對生態(tài)環(huán)境和人體健康具有不容忽視的潛在毒性效應，開展其對生態(tài)系統(tǒng)和人體健康的風險評估非常必要。

藻類作為水生生態(tài)系統(tǒng)的初級生產者，一般位于食物鏈的最底端，藻類與其他水生生物的關系十分密切，它對維持水生生態(tài)系統(tǒng)的結構和功能穩(wěn)定具有總要意義，所以藻類是監(jiān)測和評價水環(huán)境質量的重要指示生物［13］。羊角月牙藻是淡水水體中常見的藻類之一，其生長速度快，便于觀測，已有研究證實其對環(huán)境條件變化及污染物很敏感，是水環(huán)境生態(tài)毒理學研究的標準實驗生物(ISO 8692-1989)。目前，對三氯生的研究大多集中在日化產品中其含量檢測方法的建立及其在廢水中含量的檢測［4，14］，國內外只有少數文獻報道其對生物的影響或毒性效應［15-16］，然而關于三氯生對藻類的光合作用以及抗氧化酶系影響方面目前還鮮見報道。

以羊角月牙藻為實驗材料，從藻類生長速率、葉綠素含量、葉綠素熒光動力學參數以及抗氧化酶系統(tǒng)等方面評價三氯生羊角月牙藻的毒性效應，探究不同質量濃度的三氯生暴露后藻類的變化及其響應規(guī)律，為進一步研究和評價水體環(huán)境中三氯生的生態(tài)毒理效應及其潛在的生態(tài)風險提供理論依據。

1 材料與方法(M aterials and methods)

1．1 儀器和試劑

儀器:冷凍高速離心機(sigma 2-16k，德國);超低溫冰箱(Thermo forma，美國);超聲波細胞粉碎儀(UH-950B，天津);恒溫水浴鍋(HH．S21-6，上海);超聲波清洗器(Branson 3510，美國);顯微鏡(Olympus CX21，日本);計數器(KWTRIO，上海);烘箱(GZX-9076，上海);分析天平(PrecisaXS 125A-SCS，瑞士);自動蒸汽滅菌鍋(D-1，上海);酸度計(BeckmanΦ350，美國);三溫區(qū)光照培養(yǎng)箱(FPG3，寧波萊福);紫外可見分光光度計(HachDR 5000，美國)。

試劑:三氯生購于北京百靈威科技有限公司，純度≥96%，藥品于實驗當天用蒸餾水配制成母液，母液濃度為5 mg·L-1。所用其他試劑均為分析純。

1．2 實驗材料

藻種:羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)藻種由中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫提供。藻種置于恒溫光照培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，用AAM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每升培養(yǎng)基參照文獻［17］，光暗周期12 h∶12 h，于光照強度60 μmol·m-2·s-1，溫度(23 ±1)℃。每天人工搖動3次，隔96 h移動1次，反復3次以上，使之達到同步生長。每次移動前進行顯微鏡境檢，檢查藻是否污染。

1．3 毒性實驗

1．3．1 生物量測定

培養(yǎng)的藻液分別在0、24、48、72、96 h 取樣，通過在顯微鏡下用血球計數板進行藻細胞計數，同時在波長680 nm下測定的藻液光密度，建立不同藻細胞濃度和光密度之間的線性關系，實驗中以測定的光密度和根據線性方程計算出的藻細胞濃度表示細胞數。預實驗在250mL錐形瓶中進行，三氯生設置了5個間隔較大的濃度梯度(0．002、0．010、0．050、0．250、0．500 mg·L-1)和空白對照，每個濃度組設3 組平行，于0、24、48、72、96 h后定時取樣，測定680 nm波長下各實驗組藻液吸光值，用概率單位法計算96 h-EC50。

1．3．2 葉綠素a含量測定

參照王學奎的方法［18］，取經過三氯生暴露處理0、24、48、72、96 h 后藻液，3 500 × g離心分離藻體細胞，加入5 mL體積分數為95%的乙醇，振蕩搖勻，于黑暗處4℃下提取24 h。將提取液以7 000 r·min-1離心，取上清液，1 cm光徑比色皿，以體積分數為95%乙醇為空白，分別在470、663和645 nm波長下測定吸光值，根據公式葉綠素 a=13．95A663-6．88A645計算葉綠素 a［18］。

1．3．3 葉綠素熒光測定

葉綠素熒光利用植物效率儀(PEA，Hansatech Ltd．，英國)于室溫下測定。分別取不同處理濃度暴露96 h后樣品藻液，測試前藻液樣品暗適應20min。

采用的參數及其計算方法見表1，葉綠素熒光參數的分析主要是根據Appenroth和Strasser的方法［19-20］。放氧復合體的比例按公式(1)與(2)進行計算［23］。

1．4 酶活性的測定

三氯生在預實驗中96 h內使羊角月牙藻抑制率為100%的濃度為0．500 mg·L-1，急性毒性實驗設置1個空白對照和5 個三氯生暴露組(0．000、0．004、0．016、0．064、0．128和0．256mg·L-1)。實驗條件跟預實驗相同。暴露96 h后，分別取100mL的藻液于3 500×g、4℃下離心10min，棄去上清液，藻泥冷凍在-80℃冰箱待測。

測定時將離心所得藻泥再懸浮于3．0 mL 0．1 mol·L-1(pH 7．8)的磷酸鹽緩沖液中，冰浴下超聲波不連續(xù)破碎30 min，其中破碎時間3 s，間隔時間7 s，超聲波破碎儀工作功率為15 W，破碎后于4℃、7 150×g下離心15 min，上清液為粗酶液，用于酶活性的測定。

蛋白含量、GSH含量、GST活性、MDA含量和CAT活性測定均采用南京建成生物公司的試劑盒進行測定。蛋白測定采用考馬斯亮蘭法，蛋白以樣品蛋白含量μg·mL-1表示。GSH含量在波長412 nm處測定吸光度計算，GST活性以在37℃反應1 min扣除非酶促反應，使反應體系中GSH濃度降低1μmol·L-1為1個酶活力單位(U)。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法(TBA法)，以μmol·mg-1表示。CAT測定采用紫外吸收法，定義每毫克蛋白每秒鐘分解1μmol的H2O2的量為1個活力單位(U)。GST、CAT的活性和GSH、MDA的含量均以每毫克蛋白含量為標準計算，每個平行測定3次，取其平均值計算。

1．5 數據處理

同一處理時間的各指標內差異顯著性采用單因素方差分析(One-Way ANOVA，LSD)，分析軟件為SPSS 13．0，實驗結果用平均值±標準偏差(Mean±SD)表示，P＜0．05和 P＜0．01表示處理組與對照組差異顯著和極顯著。

表1 JIP-測定中快速葉綠素熒光誘導動力學曲線(O-J-I-P)的參數Table 1 Parameters in analysis of O-J-I-P chlorophyll a fluorescence transients in JIP-test

2 結果(Results)

2．1 三氯生對羊角月牙藻的毒性實驗

2．1．1 三氯生對羊角月牙藻細胞生長的影響

由圖1可見，隨著暴露時間的延長，除了高濃度組0．500 mg·L-1，各實驗濃度組藻細胞密度均逐漸升高。但隨著三氯生濃度的升高，羊角月牙藻生長受到抑制，藻細胞密度逐漸降低，并且二者呈負相關關系，有比較明顯的劑量-效應關系。三氯生濃度為0．050 mg·L-1時，羊角月牙藻的生長開始受到抑制，當三氯生濃度達到0．250 mg·L-1時，羊角月牙藻的生長受到顯著抑制，藻細胞密度顯著下降。當三氯生濃度達到0．500 mg·L-1時，藻細胞密度出現(xiàn)負增長，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)部分藻細胞壁受到破壞，藻細胞的顏色變淺。計算三氯生對羊角月牙藻的96 h-EC50為 0．112 mg·L-1，按照水生生物毒性分級［21］，三氯生對羊角月牙藻的急性毒性屬于高毒。

圖1 三氯生對羊角月牙藻生長的影響Fig．1 Effects of triclosan(TCS)on growth of S．capricornutum

圖2 三氯生對羊角月牙藻葉綠素a的影響Fig．2 Effects of TCS on chlorophyll a of S．capricornutum

2．1．2 三氯生對羊角月牙藻葉綠素a的影響

在不同濃度三氯生的處理下，羊角月牙藻葉綠素a含量的變化趨勢與細胞密度的變化趨勢基本吻合，隨著三氯生濃度的增大，培養(yǎng)液中的葉綠素a含量下降，96 h時0．500 mg·L-1處理組葉綠素含量為對照的14．6℅，48 h后開始出現(xiàn)負增長。

2．1．3 三氯生對羊角月牙藻葉綠素熒光誘導動力學影響

由圖3可見，在藻細胞光合作用的PSII供體中，羊角月牙藻放氧復合體(OEC)比例隨著三氯生濃度的升高而出現(xiàn)了大幅度下降，三氯生濃度為0．064 mg·L-1時，羊角月牙藻的放氧復合體的比值為對照的72%，當三氯生濃度達到0．256 mg·L-1時，羊角月牙藻的放氧復合體的比值還不及對照組的40%。

圖3 三氯生處理后羊角月牙藻放氧復合體比例的變化Fig．3 Changes of fraction of OEC in S．capricornutum after TCS treatment

由圖4可見，羊角月牙藻單位反應中心吸收的光能(ABS/RC)隨著三氯生濃度的升高而出現(xiàn)大幅升高，單位面積反應中心的數量(RC/CSo)出現(xiàn)明顯下降，單位反應中心所捕獲的光能(TRo/RC)略有上升，但是用于電子傳遞的量子產額(φEo)、最大光化學效率(φPo)、捕獲的激子能推動電子傳遞的效率(ψo)均有明顯下降，表明隨著三氯生濃度的升高，用于原初光化學反應及電子傳遞的能量出現(xiàn)降低，多余的光能通過熱耗散的形式進行釋放，從而導致用于熱耗散的量子產額(φDo)出現(xiàn)大幅升高，最終導致羊角月牙藻PSII性能指數(PIabs)大幅下降，當三氯生暴露濃度為0．256 mg·L-1，羊角月牙藻(PIabs)還不及對照組的2%。

Mo、Sm、φEo和 ψo等參數主要反映 PSII受體側變化。PSII受體側主要包括QA、QB和PQ庫等。Mo反映了QA被還原的最大速率，即O-J過程中QA被還原的速率［20］，它與反應中心色素、捕光色素和QA所處的狀態(tài)有關;Sm則反映了QA完全被還原所需要的能量，即PSII反應中心受體側PQ庫的大?。?2］，電子從QA進入電子傳遞鏈越多，則達到 FM所需要時間越長，Sm的值也就越大。隨著三氯生濃度的增高，Sm出現(xiàn)下降，Mo上升，使得羊角月牙藻PSII受體側PQ庫變小，電子傳遞體數量減少，QA向下傳遞的電子受到抑制，加快了QA還原效率，減少了QA還原次數，即N變小。這表明，三氯生使羊角月牙藻的PSII反應中心受損，抑制了光合作用的原初反應，阻礙了光合電子傳遞的過程。

圖4 三氯生處理后羊角月牙藻光合作用各動力學JIP-測定參數的變化Fig．4 Changes of selected JIP-test parameters for S．capricornutum after TCS treatment

2．2 三氯生對羊角月牙藻GSH和MDA含量與GST和CAT酶活性的影響

由圖5可見，隨著三氯生濃度的增加，GST和CAT活性均呈現(xiàn)出先誘導后抑制的現(xiàn)象。GST在濃度組 0．128 mg·L–1中受到極顯著誘導(P ＜0．01)，當三氯生濃度為0．256 mg·L-1時，GST活性為對照組的1．7 倍，差異不顯著(P ＞0．05)。在暴露組0．064 mg·L–1中CAT 受到顯著誘導(P ＜0．05)，當暴露濃度達到0．128mg·L-1時，CAT 含量為對照組的2．18 倍，受到極顯著誘導(P＜0．01)，CAT活性在高濃度組0．256 mg·L-1中為對照組的1．3 倍，差異不顯著(P ＞0．05)。

圖5 三氯生對羊角月牙藻CAT、GST活性與GSH、MDA含量的影響

三氯生對羊角月牙藻GSH的影響不大，其含量總體升高，只在濃度組0．128mg·L–1中受到顯著誘導(P＜0．05)。三氯生對羊角月牙藻MDA含量呈現(xiàn)誘導的現(xiàn)象，在低濃度組(0．004、0．016 mg·L–1)中，MDA含量跟對照組相差不大，隨著三氯生濃度的增加，MDA含量逐漸增加，在三氯生濃度為0．064和0．128 mg·L–1時，MDA 受到顯著誘導(P ＜0．05)，當三氯生濃度達到0．256 mg·L-1時，MDA含量為對照組的1．81 倍，達到最大，受到極顯著誘導(P ＜0．01)。

3 討論(Discussion)

3．1 三氯生對羊角月牙藻生長和葉綠素a的影響

在低濃度三氯生暴露時，隨著時間的延長，羊角月牙藻在96 h表現(xiàn)出對三氯生的逐漸適應，生長速度雖然不及對照組，但仍呈增長趨勢。隨著三氯生暴露濃度的增大，藻細胞生長受到抑制。高濃度三氯生暴露可能對羊角月牙藻光合作用等關鍵代謝過程產生了干擾，從而影響了藻的代謝和繁殖，導致藻的生長受到抑制［23］。三氯生對藻類生長的影響首先體現(xiàn)在對羊角月牙藻葉綠素a含量的影響。在三氯生暴露濃度較低時，葉綠素a含量穩(wěn)定增加，但高濃度的三氯生破壞了藻細胞的結構，使得葉綠素含量降低，藻液顏色變黃等現(xiàn)象，可能是高濃度的三氯生引起了藻細胞膜系統(tǒng)脂質過氧化而破壞了細胞和葉綠體等細胞器膜的結構，導致葉綠素合成受阻［24］。

3．2 三氯生對羊角月牙藻葉綠素熒光誘導動力學影響

植物在進行光合作用時，葉綠素吸收的光能主要用于推動光合作用，當中也有一部分在形成同化力之前以熱的形式耗散或以熒光的形式重新發(fā)射出去［25］。在正常情況下，用來進行光化學反應的能量占葉綠素吸收光能的大部分，僅有少部分以熱或熒光的形式耗散掉。但是當植物受到脅迫時，植物的光反應能力將下降，而熱耗散和葉綠素熒光形式的耗散將增加，因此，葉綠素熒光動力學的變化過程可以用來反映植物受到環(huán)境脅迫的情況。

三氯生暴露使羊角月牙藻 RC/CSo、φPo、Sm、OEC和PIabs等指數大幅下降，表明了三氯生使羊角月牙藻的PSII反應中心受損，抑制了光合作用的原初反應，阻礙了光合電子傳遞的過程。這與紅霉素對羊角月牙藻的的作用機制類似［17］。Ricart等［26］發(fā)現(xiàn)，三氯生會對藻類光合作用系統(tǒng)產生損害，藻類光合作用效率降低是藻類光合作用系統(tǒng)結構水平上受到損害的前兆。脂質不僅是復合體上內囊體基質的主要組成部分，同時也是PSII在裝配和修復過程中的重要組成部分［27］。三氯生可通過抑制酰基載體蛋白還原酶從而抑制脂肪酸的形成，進而抑制脂質的形成。脂質合成的受阻會導致PSII反應中心功能受阻，從而使原初光化學反應等重要過程無法完成，因此，RC/CSo和φPo等指標大幅下降。Kanervo等［28］發(fā)現(xiàn)D1蛋白的功能取決于內囊體膜上脂質的不飽和程度，而參與構成PSII反應中心的D1蛋白，是維持QB蛋白穩(wěn)定的重要因素之一［29］，由于三氯生暴露使D1蛋白合成受阻，導致QB易于從類囊體膜上脫落，使PSII受體庫減小，Sm下降。此外，PSII反應中心的受損，也影響到了OEC的正常組裝，使OEC的比例大幅下降，繼而影響水的光解。

3．3 三氯生對羊角月牙藻抗氧化酶系的影響

GST具有消除體內自由基和解毒雙重功能，是一種重要的解毒酶，能催化內源小分子GSH與許多次級底物結合，包括脂質過氧化的次級產物，從而解除外源性污染物的毒性［30］。實驗表明，隨三氯生暴露濃度增加，羊角月牙藻體內的GST活性也呈現(xiàn)出升高的趨勢。GST的活性與外源化合物的解毒和排除密切相關，GST活性的升高是生物體抵御外源污染物的一種應激反應機制。這可能與生物在外源污染物脅迫下產生活性氧自由基有關。有文獻報道，三氯生暴露可顯著誘導體內自由基的產生和積累［31］。本研究中MDA的持續(xù)升高也間接印證了三氯生引起了藻類體內自由基的產生，隨著自由基的積累從而誘導GST活性升高;但隨著三氯生暴露濃度的持續(xù)增加，高于 0．128 mg·L–1時，GST 的誘導呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于過高濃度三氯生造成大量自由基產生并在體內積累，抑制了GST酶的活性，這種GST活性在低濃度污染物暴露呈現(xiàn)誘導而高濃度暴露下降的變化在許多水生生物對污染物的暴露中均有報道［32-36］。

CAT是植物體內一種重要的抗氧化酶，能催化H2O2生成H2O與O2，以減輕H2O2對細胞的氧化損傷。在低濃度的三氯生暴露下，羊角月牙藻體內的CAT活性受到明顯的誘導，并且隨著三氯生濃度的增大而升高。這說明此時三氯生的暴露已經對羊角月牙藻產生了氧化脅迫作用，誘導抗氧化酶活性的啟動。隨著三氯生濃度繼續(xù)增加，超過了藻細胞的耐受極限，從而使CAT活性下降，羊角月牙藻生長受到明顯抑制。Canesi等［37］研究發(fā)現(xiàn)，三氯生暴露導致地中海貽貝的消化腺CAT活性急劇下降，其可能原因是三氯生會影響酶參與維護生物機體的氧化還原平衡。CAT的下降反映出為抵御外源親電基團的氧化，細胞體內需要消耗還原性物質同時抗氧化酶活性下降，并伴隨氧化產物MDA含量逐漸增加，也間接地反映出細胞損傷的程度［38］。

GSH是生物體內重要的非酶系抗氧化系統(tǒng)的成分，其既可由于污染物的暴露而產生適應性誘導反應［39］，也可由于污染物的毒性作用大量耗竭，導致生物體內GSH含量降低［40-41］。三氯生對羊角月牙藻體內的GSH的合成無直接抑制效應，羊角月牙藻經過96 h的暴露，GSH含量總體處于被誘導狀態(tài)，但當三氯生濃度達到 0．256 mg·L–1時，GSH 含量并沒有顯著增加。在蛋白核小球藻受到諾氟沙星藥物暴露過程中的GSH含量變化也有類似表現(xiàn)［42］。這可能和藻類體內還存在其他可猝滅氧化自由基的還原性小分子(如抗壞血酸等)有關，但本實驗沒有同時測定其他還原性小分子變化，所有不能解釋GSH相對穩(wěn)定的變化原因，這需要在今后的工作中進一步深入研究和探討。

MDA含量的上升指示了膜脂質過氧化以及氧化脅迫的存在。膜脂質過氧化由ROS引發(fā)并嚴重影響生物膜的功能及完整性，并對細胞造成不可逆的損傷［43］。本研究中，三氯生為光合作用抑制劑，它們可以阻斷羊角月牙藻PSII電子傳遞，使處于激發(fā)態(tài)的葉綠素分子可自發(fā)轉變?yōu)槿€態(tài)葉綠素，進而促使 O2轉變?yōu)?ROS，從而導致氧化脅迫的產生［44］，這一點也可從本實驗中3種抗生素導致羊角月牙藻MDA含量的顯著上升予以證明。

綜上所述，三氯生對羊角月牙藻96 h-EC50為0．112 mg·L-1，對羊角月牙藻屬于高毒物質。三氯生對羊角月牙藻葉綠素熒光動力學ABS/RC、PIabs、RC/CSo和OEC比例等參數變化比較敏感。隨著三氯生濃度的增大，羊角月牙藻的葉綠素熒光中ABS/RC大幅上升，PI-abs、RC/CSo和OEC的比例下降，當三氯生濃度為0．256mg·L-1時，ABS/RC 達到最大值，PIabs、RC/CSo和OEC比例下降為最小值，表明藻細胞光合作用的原初反應及電子鏈傳遞過程受到嚴重阻礙。三氯生對羊角月牙藻體內抗氧化酶系中GST活性和MDA也有較大影響。在低濃度暴露下，GST活性隨TCS濃度增加而增大，但當TCS濃度超過0．256 mg·L-1時，GST 活性出現(xiàn)顯著下降，同時MDA的含量達到最大，這種GST活性的下降同時伴隨MDA含量的增加表明，藻細胞膜系統(tǒng)受到較大損害。因此，光合作用過程葉綠素熒光動力學參數，如 ABS/RC、PIabs、RC/CSo和 OEC，以及抗氧化酶系統(tǒng)中GST和MDA可以作為有效的指標參數用于三氯生的毒性的評價。

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