陳聃　時(shí)浩杰等

摘 要： 【目的】了解浙江地區(qū)葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）對(duì)苯并咪唑類(lèi)殺菌劑和甾醇脫甲基抑制劑（DMI）類(lèi)殺菌劑的抗藥性現(xiàn)狀，為其防治提供依據(jù)和指導(dǎo)?！痉椒ā坎捎脜^(qū)分劑量法測(cè)定了浙江省臨安市、諸暨市和金華市的3個(gè)葡萄重要產(chǎn)區(qū)的108個(gè)葡萄炭疽病菌株對(duì)甲基硫菌靈和戊唑醇的抗藥性，并對(duì)甲基硫菌靈敏感和抗藥性菌株中的β-tubulin基因進(jìn)行了擴(kuò)增、測(cè)序和比較?！窘Y(jié)果】所采集菌株群體對(duì)甲基硫菌靈的抗藥性頻率為37.04%，且均為高水平抗藥性菌株（Ben HR），Ben HR對(duì)多菌靈和乙霉威表現(xiàn)雙重抗藥性，其β-tubulin基因的第200位密碼子從TTC突變?yōu)門(mén)AC，導(dǎo)致第200位氨基酸從苯丙氨酸（Phe）突變?yōu)榻j(luò)氨酸（Tyr）。所采集菌株群體共檢測(cè)到33個(gè)（30.56%）對(duì)戊唑醇表現(xiàn)低水平抗藥性的菌株?！窘Y(jié)論】浙江地區(qū)葡萄炭疽病菌對(duì)甲基硫菌靈、乙霉威產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，對(duì)DMIs類(lèi)殺菌劑戊唑醇的抗藥性發(fā)展迅速。

關(guān)鍵詞： 葡萄炭疽病菌； 甲基硫菌靈； 乙霉威； 戊唑醇； 抗藥性； β-tubulin基因

中圖分類(lèi)號(hào)：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪04-0665-04

葡萄是我國(guó)重要的果樹(shù)，近10年栽培面積和產(chǎn)量一直呈上升趨勢(shì)[1]。浙江省地理位置優(yōu)越，葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，到2010年，全省已有葡萄栽培面積2萬(wàn)hm2以上。葡萄作為重要的果樹(shù)經(jīng)濟(jì)作物，已成為浙江省農(nóng)民增收的重要渠道。

葡萄炭疽病是葡萄上重要的真菌病害之一。膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Sacc.）是引起該病的病原菌之一，有性世代屬于子囊菌亞門(mén)，子囊菌綱，球殼菌目，小叢殼屬的圍小叢殼菌（Glomerel ciagulata （Ston） Spauld et schrenk），自然條件下罕見(jiàn)[2]。膠孢炭疽菌的寄主廣泛，不同的?；涂梢郧秩径喾N不同的作物，如香蕉、杧果、辣椒、草莓、蘋(píng)果、桃等[2-6]，且因與寄主之間協(xié)同進(jìn)化和受環(huán)境影響如農(nóng)藥等因素的作用，產(chǎn)生的變異相對(duì)較多，也較快。因此，對(duì)這些變化的跟蹤和研究也非常有必要，國(guó)內(nèi)外也有很多相關(guān)研究[4]。

目前生產(chǎn)上用于葡萄炭疽病防治的主要藥劑有苯并咪唑類(lèi)的多菌靈和甲基硫菌靈，甾醇脫甲基抑制劑類(lèi)（DMIs）的戊唑醇和咪鮮胺等。國(guó)內(nèi)外在很多種致病真菌上已有關(guān)于對(duì)苯并咪唑類(lèi)殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的報(bào)道，如小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）[7-8]和灰霉病菌（Botrytis cinerea）[9]。國(guó)內(nèi)，葉佳等[10]報(bào)道的浙江省葡萄炭疽病菌已對(duì)甲基硫菌靈產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，但具體抗性機(jī)制還不清楚。葉佳等[9]報(bào)道浙江省葡萄炭疽病菌已對(duì)戊唑醇出現(xiàn)了敏感性分化，但進(jìn)一步的發(fā)展情況還有待研究。

本研究定性測(cè)定了從浙江省葡萄重要產(chǎn)區(qū)采集的108株葡萄炭疽病菌株對(duì)甲基硫菌靈、多菌靈·乙霉威和戊唑醇的敏感性，并研究了葡萄上膠孢炭疽菌的對(duì)甲基硫菌靈的抗性分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 菌株的采集、分離和鑒定

1.2 供試藥劑

1.3 對(duì)甲基硫菌靈的抗藥性檢測(cè)

1.4 甲基硫菌靈抗性菌株對(duì)多菌靈·乙霉威的雙重抗藥性測(cè)定

1.5 葡萄炭疽病菌β-tubulin基因序列的擴(kuò)增和測(cè)序

選取對(duì)甲基硫菌靈的敏感性菌株和抗性菌株各4株，在PDA培養(yǎng)基上于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d后，用滅過(guò)菌的載玻片刮取菌絲，放入滅過(guò)菌的研缽中。在研缽中加入適量液氮并研磨成粉末狀。DNA提取采用真菌基因組DNA快速抽提取試劑盒（SK2082）（上海生工）。引物序列根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的引物序列，TubGF（5-TCTCGATGT-TATCCGCCG-3），TubGR （5-TGAGCTCAGGAACACTGACG-3） [11]，由上海生工生物合成。PCR擴(kuò)增采用即用PCR擴(kuò)增試劑盒（上海生工）。PCR 參數(shù)為94 ℃預(yù)變性5 min，然后經(jīng)94 ℃變性60 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次，最后 72 ℃延伸5 min[11]。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳，割膠純化回收后，直接送上海生工測(cè)定，結(jié)果用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.6 對(duì)DMI類(lèi)殺菌劑戊唑醇的抗藥性檢測(cè)

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄炭疽病菌對(duì)甲基硫菌靈的抗藥性頻率

2.2 對(duì)多菌靈和乙霉威的雙重抗藥性

2.4 葡萄炭疽病菌對(duì)戊唑醇的抗藥性頻率

3 討 論

對(duì)苯并咪唑類(lèi)殺菌劑的抗藥性菌株主要有兩種類(lèi)型： Ben R1和Ben R2。在苯并咪唑類(lèi)殺菌劑使用以前，田間菌株為Ben S，Ben S菌株對(duì)苯并咪唑類(lèi)殺菌劑敏感、同時(shí)對(duì)乙霉威表現(xiàn)抗藥性（二者之間存在負(fù)交互抗藥性）；苯并咪唑類(lèi)殺菌劑大量連續(xù)使用以后，田間開(kāi)始出現(xiàn)Ben R1菌株。Ben R1對(duì)苯并咪唑類(lèi)殺菌劑表現(xiàn)為高水平抗藥性，但對(duì)乙霉威敏感。于是多菌靈和乙霉威的復(fù)配制劑被大量用于對(duì)Ben R1的治理，田間開(kāi)始出現(xiàn)Ben R2菌株[12-13]。Ben R2菌株表現(xiàn)為抗苯并咪唑類(lèi)殺菌劑，同時(shí)對(duì)乙霉威表現(xiàn)抗藥性，即雙重抗藥性菌株[12]。

本研究檢測(cè)了浙江省葡萄產(chǎn)區(qū)臨安、諸暨和金華3地葡萄炭疽菌群體對(duì)苯并咪唑類(lèi)殺菌劑甲基硫菌靈的抗藥性。從研究結(jié)果看，以上三地的葡萄炭疽病菌已對(duì)甲基硫菌靈產(chǎn)生了較嚴(yán)重的抗藥性，抗性頻率37.04%。膠孢炭疽菌對(duì)苯并咪唑類(lèi)殺菌劑的高頻率抗性會(huì)導(dǎo)致苯并咪唑類(lèi)殺菌劑對(duì)葡萄炭疽病的防治效果下降[14-15]。鑒于多菌靈和甲基硫菌靈有正交互抗性，因此認(rèn)為這三個(gè)地區(qū)在葡萄上應(yīng)減少使用苯并咪唑類(lèi)藥劑。并且此類(lèi)菌株對(duì)多菌靈·乙霉威也產(chǎn)生了抗性，即為雙重抗藥性菌株。說(shuō)明臨安、諸暨和金華3地的葡萄炭疽菌群體對(duì)咪唑類(lèi)殺菌劑已產(chǎn)生Ben R2抗性類(lèi)型。

供試菌株中30.56%對(duì)戊唑醇產(chǎn)生低水平抗藥性，這與葉佳等[9]2011年采集的浙江省78個(gè)葡萄炭疽病菌株中2個(gè)菌株對(duì)戊唑醇的敏感性明顯較低的報(bào)道相比，抗性水平迅速提高，敏感性分化更為明顯，說(shuō)明在浙江省此類(lèi)藥劑的抗性發(fā)展較快，因此為延緩對(duì)戊唑醇抗藥性的產(chǎn)生[15]，筆者建議使用不同作用位點(diǎn)的殺菌劑與對(duì)此類(lèi)藥劑混用或交替使用。

4 結(jié) 論

浙江省臨安、諸暨等地區(qū)葡萄炭疽病菌已對(duì)甲基硫菌靈、乙霉威產(chǎn)生了較為嚴(yán)重的抗藥性，抗性機(jī)制為β-Tubulin基因密碼子第200位苯丙氨酸（Phe）變?yōu)榻j(luò)氨酸（Tyr），建議該地區(qū)減少使用這兩類(lèi)殺菌劑，否則會(huì)因用量過(guò)大造成環(huán)境污染；與之前報(bào)道相比，浙江省葡萄炭疽病菌對(duì)戊唑醇的抗藥性水平發(fā)展迅速，建議生產(chǎn)中盡量避免此類(lèi)藥劑單一，以延緩對(duì)此類(lèi)殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生。

參考文獻(xiàn) References：

[1] LI Hua， FANG Yu-lin. Study on the mode of sustainable viticulture： Quality， Stability， Longevity and Beauty[J]. Science Technology， 2005， 23（9）： 20-22.

李華，房玉林. 論葡萄產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展模式的目標(biāo)—優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)產(chǎn)、長(zhǎng)壽、美觀[J]. 科技導(dǎo)報(bào)，2005，23（9）： 20-22.

[2] LI Yang. Study on carbendazim-resistant Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Sacc. in Liaoning[D]. Lanzhou： Gansu Agricultural University， 2009.

李洋. 遼寧葡萄炭疽病菌對(duì)多菌靈抗藥性研究[D]. 蘭州： 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[3] KEFIALEW Y， AYALEW A. Postharvest biological control of anthracnose （Colletotrichum gloeosporioides） on mango （Mangifera indica）[J]. Postharvest Biology and Technology， 2008（50）： 8-11.

[4] THAN P，JEEWON R，HYDE K D，PONGSUPASAMIT S，MINGKOLPORN O， TAYLOR P W J. Characterization and pathogenicity of Colletotrichum species associated with anthracnose on chilli （Capsicum spp.） in Thailand[J]. Plant Pathology， 2008（57）： 562-572.

[5] BERNSTEIN B， ZEHR E I， DEAN R A， SHABI E. Characteristics of Colletotrichum from peach， apple， pecan， and other hosts[J]. Plant Disease，1995， 79： 478-482.

[6] MAYMON M， ZVEIBIL A， PIVONIA S， MINZ D， FREEMAN S. Identification and characterization of benomyl-resistant and-sensitive populations of Colletotrichum gloeosporioides from Statice （Limonium spp.）[J]. Phytopathology， 2006， 96： 542-548.

[7] LU Yue-jian， ZHOU Ming-guo， YE Zhong-yin， HOLLOMON D W， Butters J A. Cloningg and characterization of β-tubulin gene fragment from carbendazim resistance stirain of Fusarium gramineamm[J]. Acta Phytopathologica Sinica， 2000， 30（1）： 30-34.

陸悅健，周明國(guó)，葉鐘音，Hollomon D W，BUTTERS J A. 抗苯并咪唑的小麥赤霉病菌β-tubulin 基因序列分析與特性研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2000，30（1）： 30-34.

[8] LI Hong-xia， LU Yue-jian， WANG Jian-xin， ZHOU Ming-guo. Comparisonof mutations in the β-tubulin gene that confer resistance to carbendazimin four plant pathogenic fungi[J]. Journal of Nanjing Agricultural University， 2002， 25 （3）： 41- 44.

李紅霞，陸悅健，王建新，周明國(guó). 四種不同植物病原真菌與多菌靈抗藥性相關(guān)基因突變的比較[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，25 （3）： 41- 44.

[9] YE Jia， ZHANG Chuan-qing. Detection of sensitivity of grape anthracnose to thiophanate methyl， tebuconazole and kresoxim-methyl[J]. Chinese Journal of Pesticide Sciences， 2012，14（1）： 111-114.

葉佳，張傳清. 葡萄炭疽病菌對(duì)甲基硫菌靈、戊唑醇和醚菌酯的敏感性檢測(cè)[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，14（1）： 111-114.

[10] ZHANG Chuan-qing， ZHANG Ya， WEI Fang-lin， LIU Shao-ying， ZHU Guo-nian. Detection of resistance of Botryotinia fuckeliana from protected vegetables to different classes of fungicides[J]. Chinese Journal of Pesticide Sciences， 2006， 8（3）： 245-249.

張傳清，張雅，魏方林，劉少穎，朱國(guó)念. 設(shè)施蔬菜灰霉病菌對(duì)不同類(lèi)型殺菌劑的抗性檢測(cè)[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，8（3）： 245-249.

[11] CHUNG Wen-hsin， CHUNG Wen-chuan， PENG Mun-tsu， Hong-Ren-yang， HUANG Jenn-wen. Specific detection of benzimidazole resistance in Colletotrichum gloeosporioides from fruit crops by PCR-RFLP[J]. N Biotechnol， 2010， 27（1）： 17-24.

[12] ZHANG C Q， LIU Y H， ZHU G N. Detection and characterization of benzimidazole resistance of Botrytis cinerea in greenhouse vegetables[J]. European Journal of Plant Pathology， 2010，126， 509-515.

[13] YOUNG J R， TOMASO-PETERSON M. Two Mutations in β-Tubulin 2 Gene Associated with Thiophanate-Methyl Resistance in Colletotrichum cereale Isolates from Creeping Bentgrass in Mississippi and Alabama[J]. Plant Disease，2010，94： 207-212.

[14] MACKENZIE S J， MERTELY J C， PERES N A. Curative and protectant activity of fungicides for control of crown rot of strawberry caused by Colletotrichum gloeosporioides[J]. Plant Disease，2009，93（8）： 815-820.

[15] DENG Wei-ping， YANG Min， DU Fei， LIU Yi-xiang， ZHANG Li-tao， YAN Ying-ying， WANG Si-qi， YANG Ji-zhong， HE Xia-hong， ZHU Shu-sheng. Sensitivity of Colletotrichum gloeosporioides causing grape anthracnose to three sterol demethylation inhibitor （DMI） fungicides[J]. Chinese Journal of Pesticide Sciences， 2011， 13（3）： 245-252.

鄧維平，楊敏，杜飛，劉屹湘，張麗韜，閆瑩瑩，汪思齊，楊積忠，何霞紅，朱書(shū)生. 葡萄膠孢炭疽菌對(duì)3種麥角甾醇脫甲基抑制劑類(lèi)殺菌劑的敏感性[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13（3）： 245-252.