馬倩倩　宋躍等

摘 要：【目的】建立超聲波處理‘黃花梨花粉介導(dǎo)插入外源基因的技術(shù)體系?！痉椒ā恳浴S花梨花粉為試材，檢測(cè)不同蔗糖溶液中梨花粉破損率；通過(guò)中心組合設(shè)計(jì)方法，對(duì)超聲波處理功率、處理時(shí)間、間隙時(shí)間、處理次數(shù)4個(gè)因子進(jìn)行優(yōu)化；利用含熒光蛋白基因的表達(dá)載體pCAMBIA 1304檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率?！窘Y(jié)果】梨花粉的適宜等滲溶液為15 g·L-1蔗糖溶液。超聲波處理的梨花粉受體最佳參數(shù)為：超聲波處理功率160～170 W，處理時(shí)間6～7 s，間隙時(shí)間7 s，處理次數(shù)7 次。 采用加入含GFP（green fluorescent protein）基因的pCAMBIA 1304表達(dá)載體質(zhì)粒檢測(cè)優(yōu)化的超聲波處理組合，梨花粉外源基因的插入效率為3%?！窘Y(jié)論】研究確定了超聲波處理‘黃花梨花粉遺傳轉(zhuǎn)化體系。

關(guān)鍵詞： ‘黃花梨； 花粉介導(dǎo)； 超聲波處理； 轉(zhuǎn)化體系； GFP基因

中圖分類號(hào)：S661.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪04-0537-06

梨是我國(guó)的第三大果樹(shù)樹(shù)種，其果實(shí)以爽口多汁、味美多樣、營(yíng)養(yǎng)豐富而深受消費(fèi)者喜愛(ài)。但是，由于梨的雜種苗童期較長(zhǎng)，多數(shù)重要性狀受多基因遺傳控制，同時(shí)為克服自交不親和性而長(zhǎng)期進(jìn)行品種間雜交導(dǎo)致的基因組高度雜合等問(wèn)題，使得梨的遺傳改良效率相對(duì)較低，很難滿足現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展的要求[1]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展以及對(duì)果樹(shù)基因組學(xué)研究的不斷深入，利用基因工程技術(shù)手段直接對(duì)目標(biāo)農(nóng)藝性狀進(jìn)行定向遺傳改良，成為加速梨品種改良進(jìn)程的一個(gè)重要選擇途徑。

目前梨上應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因方法主要是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，該轉(zhuǎn)基因方法比較依賴于組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化體系建立，但不同梨品種之間的誘導(dǎo)再生效率差異較大[2]。例如，在NN69培養(yǎng)基上，‘Seckel品種的再生率為84%，而‘Louise Bonne Panachee僅有42%[3]。Leblay等[4]通過(guò)對(duì)‘Conference及‘Passe-Crassane葉片進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)2者的再生能力相差約50%。還有研究表明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)梨的轉(zhuǎn)基因效率很低，Zhu等[5]在西洋梨砧木轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，在3500張感染的葉片中都沒(méi)有得到再生植株。而且，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染梨葉片后不定芽再生率也很低，如‘碭山酥梨的再生率最高僅為19.09%[6]，‘豐產(chǎn)梨（Pyrus communis L.）的再生率最高僅為8.1%[7]。因此，十分有必要探索和尋找避免組織培養(yǎng)或植株再生的遺傳轉(zhuǎn)化方法?；ǚ酃芡ǖ婪ㄊ且环N在植物上應(yīng)用相對(duì)較多的非組培轉(zhuǎn)基因方法[8]，在小麥[9]、水稻[10]和棉花[11-12]都曾成功獲得變異子代。但是其操作難度較大，轉(zhuǎn)化率低，結(jié)果可重復(fù)性差[13]，目前較少應(yīng)用。而超聲波處理花粉介導(dǎo)法是經(jīng)改良的花粉管通道法，這種遺傳轉(zhuǎn)化方法簡(jiǎn)便、易操作，具有較強(qiáng)的實(shí)用性，不僅在玉米[14]、谷子[15]、花生[16]、野罌粟[17]等物種上成功獲得轉(zhuǎn)基因植株，在多年生果樹(shù)如蘋果[18]、葡萄[19]也嘗試建立了相應(yīng)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，但在梨樹(shù)上的探索和應(yīng)用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，我們以‘黃花梨為試驗(yàn)材料，擬通過(guò)對(duì)影響轉(zhuǎn)化效率的花粉及超聲波處理有關(guān)參數(shù)的比較分析，以建立優(yōu)化的梨花粉介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系，從而為該方法在梨轉(zhuǎn)基因上的應(yīng)用提供良好的技術(shù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

‘黃花梨是生產(chǎn)中常用的授粉品種，因此選該品種為試驗(yàn)材料。采集處于大蕾期的‘黃花梨花朵，取花藥部分，在25 ℃干燥環(huán)境中，晾曬至暴出花粉。花粉可直接使用，或低溫、干燥條件下保存于干燥硅膠中備用。樣品采自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院梨種質(zhì)資源圃。

1.2 梨花粉等滲溶液的篩選

取適量的‘黃花梨花粉分別懸浮于10、12.5、15、17.5、20、30 g·L-1蔗糖溶液（pH 6.5左右）中，在4 ℃冰箱中靜置0.5 h。取處理后的花粉溶液滴在載玻片上，用×40倍的顯微鏡觀察花粉的破損率（破損花粉包括處于發(fā)生質(zhì)壁分離和細(xì)胞發(fā)生破裂兩種狀態(tài)下的花粉細(xì)胞）。每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)，且每次隨機(jī)選取視野，直至觀察到1 000個(gè)花粉細(xì)胞為止，并統(tǒng)計(jì)花粉破損結(jié)果。整個(gè)操作過(guò)程在冰浴條件下進(jìn)行。

1.3 超聲波處理?xiàng)l件的優(yōu)化

試驗(yàn)按照四因素五水平（表1）中心組合設(shè)計(jì)的組合進(jìn)行超聲波處理花粉，每次取0.06 g純凈花粉懸浮于3 mL花粉等滲溶液中，依次按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2）進(jìn)行超聲波處理，處理過(guò)的花粉沉淀15 min后，用膠頭滴管取底部花粉溶液滴在載玻片上，用×40倍的顯微鏡觀察，每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)，且每次隨機(jī)選取視野，觀察花粉破損率，直至觀察至1 000個(gè)花粉細(xì)胞為止，并統(tǒng)計(jì)花粉破損結(jié)果。破損花粉包括處于發(fā)生質(zhì)壁分離和細(xì)胞發(fā)生破裂2種狀態(tài)的花粉細(xì)胞。整個(gè)操作過(guò)程進(jìn)行冰浴處理。

1.4 外源質(zhì)粒載體的提取

選用含有GFP（green fluorescent protein）基因的pCAMBIA 1304 表達(dá)載體質(zhì)粒（由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院楊清教授贈(zèng)予）為外源DNA。從LB固體平板上挑取抗性單克隆菌落接種于1.5 mL 含100 mg·mL-1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃ 250 r·min-1震蕩培養(yǎng)5～6 h至飽和，然后將液體全部轉(zhuǎn)入含有20 mL LB液體培養(yǎng)基的50 mL離心管中，37 ℃ 250 r·min-1震蕩培養(yǎng)8～10 h。取2 mL菌液用堿裂解法提取質(zhì)粒載體。

1.5 外源基因插入梨花粉的效率檢測(cè)

取0.06 g純凈花粉懸浮于3 mL花粉等滲溶液中，按照超聲波處理參數(shù)最佳組合進(jìn)行1次處理，然后加入10 μL 濃度為70 mg·L-1 pCAMBIA 1304表達(dá)載體質(zhì)?；靹蚝?，重復(fù)進(jìn)行1 次相同超聲波處理，該過(guò)程全部在冰浴條件下進(jìn)行。處理后靜置15 min，倒掉上清，用膠頭滴管吸取沉底的花粉，滴在固體培養(yǎng)基[20] [30 mmol·L-1 MES（2-（4-Morpholino） ethanesulfonic aci），0.01%硼酸，0.03% CaCl2·2H2O，15.0%PEG（聚乙二醇）-4000，10% 蔗糖，pH值在6.5 左右，1.2%低熔點(diǎn)瓊脂糖]上，25 ℃避光條件下，培養(yǎng)2 h，在宏光變倍體式熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司 設(shè)備型號(hào)：MVX10）下觀察，用藍(lán)光激發(fā)固體培養(yǎng)基的花粉，以統(tǒng)計(jì)外源基因的轉(zhuǎn)化效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉等滲溶液的選擇

2.2 超聲波處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3 含GFP基因pCAMBIA 1304表達(dá)載體質(zhì)粒的檢測(cè)

2.4 以梨花粉為介導(dǎo)的GFP載體轉(zhuǎn)化效率

用上述篩選的最佳超聲波處理參數(shù)條件，即超聲波處理功率160～170 W、處理時(shí)間6～7 s、間隙時(shí)間7 s、處理次數(shù)7次，對(duì)懸浮于15 g·L-1蔗糖等滲溶液中的梨花粉進(jìn)行1次超聲波處理后，加入pCAMBIA 1 304質(zhì)粒，再進(jìn)行1次相同條件的超聲波處理。處理后取沉底花粉置于固體培養(yǎng)基上，25 ℃避光培養(yǎng)2 h，將載玻片置于體式熒光顯微鏡下，用藍(lán)光激發(fā)觀測(cè)外源基因表達(dá)結(jié)果。由圖版可見(jiàn)，發(fā)綠色熒光的萌發(fā)花粉細(xì)胞即為轉(zhuǎn)化成功的花粉細(xì)胞，觀測(cè)多個(gè)視野中相似花粉細(xì)胞，并統(tǒng)計(jì)外源基因轉(zhuǎn)化‘黃花梨花粉的效率為3%。

3 討 論

采用花粉作為轉(zhuǎn)化載體時(shí)，花粉細(xì)胞極易在溶液中吸脹破裂而失去活性，而在高濃度溶液中由于反滲作用會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重質(zhì)壁分離影響花粉粒在柱頭萌發(fā)；因此，必須選擇含一定滲透壓的溶液作為介質(zhì)，使外源DNA既能與花粉粒充分接觸，又能維持花粉粒正常的膨壓。蔗糖溶液就是一種既可產(chǎn)生一定滲透壓又不嚴(yán)重影響花粉活力的溶質(zhì)，故本試驗(yàn)通過(guò)不同濃度的蔗糖溶液對(duì)比試驗(yàn)，確定15 g·L-1蔗糖溶液為梨花粉最佳等滲溶液。這一結(jié)論與梨花粉在蔗糖濃度為15 g·L-1時(shí)花粉萌發(fā)率最高[10]相一致。而玉米和蘋果上分別采用5%、10%蔗糖溶液為超聲波處理等滲溶液[14，18]，葡萄上采用25%蔗糖溶液為超聲波處理等滲溶液[19]，可見(jiàn)，不同植物花粉粒所需蔗糖等滲溶液濃度是各不相同的。這可能是由于不同植物花粉細(xì)胞中淀粉、蛋白質(zhì)、脂類、無(wú)機(jī)鹽等物質(zhì)的含量不同，因此它們的花粉細(xì)胞內(nèi)滲透壓也各不相同。

在外源基因?qū)牖ǚ哿５倪^(guò)程中，影響超聲波處理結(jié)果的因素有處理功率、處理時(shí)間、處理間隙時(shí)間、處理次數(shù)等。綜合考慮這4個(gè)因素之間可能存在交互作用，本試驗(yàn)利用四因素五水平進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并篩選出梨花粉最佳超聲波處理參數(shù)為：超聲波處理功率160～170 W、處理時(shí)間6～7 s、間隙時(shí)間7 s、處理次數(shù)7次。從轉(zhuǎn)化機(jī)理方面分析，花粉介導(dǎo)法的關(guān)鍵在于不嚴(yán)重?fù)p傷花粉細(xì)胞，使它能攜帶外源DNA、并隨花粉管生長(zhǎng)順利進(jìn)入胚囊，形成合子，從而直接得到轉(zhuǎn)基因種子[9]。與對(duì)葡萄花粉進(jìn)行超聲波處理相比[19]，梨超聲波處理的最佳組合處理強(qiáng)度偏大。因此，也進(jìn)一步說(shuō)明了不同植物的花粉導(dǎo)入外源基因所需要的超聲波處理?xiàng)l件存在差異，均應(yīng)優(yōu)化不同物種適宜的超聲波處理參數(shù)，作為前期的技術(shù)保障。同時(shí)，本研究還采用報(bào)告基因表達(dá)載體進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)化體系的有效性和高效性。GFP基因作為報(bào)告分子和細(xì)胞標(biāo)記最明顯的優(yōu)勢(shì)是無(wú)需底物或輔因子參與，無(wú)論在活細(xì)胞還是在完整的轉(zhuǎn)基因胚胎和動(dòng)物中，都能有效地監(jiān)測(cè)基因轉(zhuǎn)移的效率[21]。GUS也常作為報(bào)告基因，但其檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性很高，并且花粉內(nèi)源性GUS會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成嚴(yán)重的干擾[22]。因此，本試驗(yàn)選用GFP作為花粉轉(zhuǎn)基因的報(bào)告基因，在優(yōu)化的超聲波處理參數(shù)條件下，利用GFP基因轉(zhuǎn)入梨花粉的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到3%，相比葡萄的花粉轉(zhuǎn)化效率4‰提高了近10倍[19]，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了本試驗(yàn)所篩選的超聲波處理參數(shù)為有效參數(shù)，該轉(zhuǎn)化體系可用于目標(biāo)基因?qū)娴倪z傳轉(zhuǎn)化研究。

綜合以上研究來(lái)看，超聲波處理梨花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方法是一種非組培轉(zhuǎn)基因方法，不受基因型、再生能力等因素的制約，與傳統(tǒng)的梨雜交育種相比，僅僅增加了超聲波處理步驟，試驗(yàn)成本低且易操作，易被廣大育種者應(yīng)用到改良梨品種的實(shí)踐中。此外，研究表明，梨的花粉在低溫、干燥的條件下貯藏 1 a后，平均花粉發(fā)芽率仍可達(dá)到73.8%，無(wú)明顯下降[23]。因此，我們不僅可利用梨的新鮮花粉為受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，也可以使用經(jīng)過(guò)保存仍具有良好萌發(fā)率的貯藏花粉為受體，從而解決花期不遇的問(wèn)題。因此，本研究建立的超聲波處理介導(dǎo)花粉轉(zhuǎn)基因方法對(duì)于梨的定向遺傳改良具有重要的理論和實(shí)踐意義。（本文圖版見(jiàn)封2）

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