劉月霞　馮建榮等

摘 要：【目的】為了獲得杏中亞生態(tài)品種群中自交不親和花粉特異表達的SFB基因全長，探討SFB基因序列多態(tài)性，【方法】以中亞生態(tài)品種群‘饅頭玉呂克和‘索格佳娜麗2個杏品種為材料，利用RT-PCR及RACE技術(shù)和DNAMAN軟件分析，克隆得到了2個新的SFB基因的全長cDNA，SFB33（HQ148064）和SFB50（HQ148074）。【結(jié)果】SFB33全長1 378 bp，SFB50全長1 313 bp，兩個基因開放閱讀框均為1 131 bp，編碼376個氨基酸；與GenBank上已登錄的SFB基因核苷酸序列進行Blast比對，SFB33基因與SFB-c（FJ362527）同源性為79%；SFB50基因與SFB23（EU652886）同源性為99%。在兩個基因上均找到F-box區(qū)域和兩個變異區(qū)及兩個高變區(qū)。李亞科SFB氨基酸序列同源性比對顯示SFB50與李亞科其他SFB基因親緣關(guān)系較近，而SFB33與李亞科其他SFB基因親緣關(guān)系較遠?！窘Y(jié)論】杏中亞生態(tài)品種群中SFB基因顯示明顯的序列多態(tài)性。

關(guān)鍵詞： 杏； 自交不親和； SFB基因； 序列

中圖分類號：S662.2 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980？穴2013？雪04-0551-07

新疆是世界杏重要的起源中心之一，現(xiàn)有杏屬（Armeniaca Mill.）植物品種資源200多個類型，種質(zhì)資源極為豐富[1]。新疆杏屬于中亞生態(tài)品種群，多數(shù)自交不親和、產(chǎn)量低而不穩(wěn)[1-2]，使新疆杏生產(chǎn)中授粉成本高且費時費力，因此自交親和品種的選育工作具有重要意義。

杏自交不親和的機制與薔薇科植物其他果樹一樣，屬于S-RNase體系的配子體自交不親和系統(tǒng)，受一個具有復等位基因的S-基因位點控制，S-基因位點至少包括兩個基因，一個是雌蕊基因，決定雌蕊的SI反應(yīng)，在花柱中特異表達，其編碼產(chǎn)物為S糖蛋白，具有RNase的活性，因而稱為S-RNase，它能分解來自相同基因的花粉RNA（rRNA和mRNA），從而抑制離體花粉管生長[3-4]；另一個是花粉S-基因，花粉S基因蛋白產(chǎn)物是一種F-box蛋白，因而稱為SFB（S-haplotype-specific F-box protein）[5-7]或SLF[8]。S-基因位點又被稱為S-單元型（S-haplotype），同一S-單元型的雌雄S-基因產(chǎn)物相互識別后，將導致自交不親和反應(yīng)[9]?；ㄖ鵖-RNase基因，已在許多植物上已經(jīng)被成功克隆[4]。花粉S-決定子S-F-box基因的研究相對于花柱S-RNase來說相對較少，目前已經(jīng)在扁桃[10]、梅[8]、櫻桃[6]、歐洲杏[11]、酸櫻桃[12]和中國杏[13]等物種中克隆到了此基因。Ushijima等[14]認為SFB 基因具有F-box基區(qū)域，含有兩個變異區(qū)及兩個高變區(qū)，其中一個變異區(qū)及兩個高變區(qū)均位于3端，高變區(qū)的存在和S- RNase相似，是自交不親和的作用位點，通過突變的方式改變此區(qū)域的序列，可以降低SFB與S-RNase的識別能力。張曉明等[15]發(fā)現(xiàn)的3末端變異區(qū)決定了SFB基因的多態(tài)性。如在甜櫻桃上4個親和突變品種中3個都是由于花粉部分突變產(chǎn)生的，“JI2434”品種是由于X-射線導致S3的SFB基因完全缺失，花柱S-RNase基因沒有發(fā)生改變[16]；“JI4240”是S4與S4相比，發(fā)現(xiàn)在2個高變區(qū)上游缺失了4個堿基，導致移碼突變，正是因為缺失，使翻譯提前終止，氨基酸序列不含2個高變區(qū)，發(fā)生S4的SFB突變[16-17]；意大利親和甜櫻桃品種“Kronio”上發(fā)現(xiàn)是由于S5的終止密碼子提前，使得SFB編碼區(qū)被短截了[18]。Sf是日本杏（P. mume）中的自交親和基因，研究發(fā)現(xiàn)其自交親和的原因是因為PmSFB在中部存在1個6.8 kb的插入片段，致使C末端的翻譯提前終止，氨基酸序列也缺乏兩個高變區(qū)[17]。對這些親和品種親和突變原因的認識有助于我們更好的了解果樹GSI的機理。本研究組前期開展了南疆杏品種自交不親和S-RNase基因型的鑒定[19]以及SFB基因的克隆及實時定量表達[20]，旨在通過了解南疆杏自交不親和基因的序列結(jié)構(gòu)特點，為今后通過RNA干擾技術(shù)誘使自交不親和基因在識別反應(yīng)中沉默，從而改良自交不親和品種。我們

以2個完全自交不親和中亞杏品種花粉為試材，通過RT-PCR和RACE獲得了2個SFB基因的全長，為從分子水平上解析新疆杏自交不親和花粉SFB基因，改良自交不親和杏品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

本試驗于2010年3月下旬至4月初于新疆農(nóng)業(yè)科學院輪臺國家果樹資源圃采集‘饅頭玉呂克和‘索格佳娜麗品種成齡杏樹氣球期的花蕾，帶回室內(nèi)，用鑷子剝?nèi)』ㄋ?，置于陰涼干燥處晾干，收集?.5 mL離心管中，添加變色硅膠顆粒后置于-70 ℃低溫保存。

1.2 總RNA的提取及RT-PCR

1.3 基因全長的克隆

所有的樣品至少5個測序重復，測序均在華大基因（北京）完成，將測序結(jié)果用DNAMAN（版本6.0.3.99）軟件進行分析，分析校對后的核苷酸序列在GenBank中Blast，將本實驗克隆所得到的基因與已經(jīng)登錄的李亞科其他SFB基因推導的氨基酸序列進行結(jié)構(gòu)分析，并用DNAMAN軟件多序列比對，參數(shù)為默認值，構(gòu)建種系同源樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏SFB基因全長的克隆及序列分析

2.2 薔薇科杏屬花粉SFB基因氨基酸序列比較和結(jié)構(gòu)分析

2.3 薔薇科李亞科花粉SFB基因同源性及系統(tǒng)進化分析

3 討 論

本研究利用RT-PCR和RACE技術(shù)從兩個南疆杏品種中獲得了兩個全長的SFB基因，并利用生物信息學的方法對SFB基因進行了分析?？寺〉玫降闹袊踊ǚ跾FB基因具有F-box基因的基本結(jié)構(gòu)，含有兩個變異區(qū)及兩個高變區(qū)，SFB差異的堿基分散在整個序列中，其中一個變異區(qū)及兩個高變區(qū)（V2、HVa和HVb）均位于3'端，這與郭長奎等[22]在扁桃中克隆得到的花粉全長SFB基因的結(jié)構(gòu)相似。Ushijima等[17]認為SFB高變區(qū)的存在和S- RNase相似，是自交不親和的作用位點，通過突變的方式改變此區(qū)域的序列，降低SFB與S-RNase的識別能力。本研究得到的花粉SFB基因在3'端有兩個高變區(qū)，其中HVa區(qū)比HVb顯示更明顯的多態(tài)性，通過干擾高變區(qū)表達，影響花粉S基因的識別專一性，從而產(chǎn)生自交親和突變，可以作為研究自交親和突變機制的突破口，也可以為今后通過遺傳轉(zhuǎn)化培育自交親和果樹品種提供研究策略。

張釗等[2]按照杏的起源、生態(tài)、生物學特性等方面的研究，認為‘索格佳娜麗屬于中亞細亞生態(tài)品種群，是一個最古老而變異最多的類群；‘饅頭玉呂克屬于歐洲生態(tài)品種群，起源歷史較短，約有2000多年?！z頭玉呂克與‘索格佳娜麗表現(xiàn)出的遺傳差異是起源演化上的差異，還是不同生態(tài)群的差異表現(xiàn)，尚需要克隆更多屬于這兩個生態(tài)群的不同品種的SFB基因進行驗證；同時，SFB33所表現(xiàn)出的這種同源差異，要想明確它和其他SFB基因之間的關(guān)系，也需要分離鑒定更多的相關(guān)基因來驗證，可為進一步深入研究新疆杏S基因型的演化關(guān)系提供寶貴的材料。

4 結(jié) 論

本實驗成功克隆新疆兩個杏品種‘饅頭玉呂克和‘索格佳娜麗SFB基因全長：SFB33和SFB50，SFB33全長1 378 bp，SFB50全長1 313 bp，兩個基因開放閱讀框均為1 131 bp，編碼376個氨基酸?；蛐蛄斜葘︼@示與薔薇科其他植物SFB基因同源率最高達到77%和99%，親緣關(guān)系比顯示SFB50與李亞科其他SFB基因親緣關(guān)系較近，SFB33與李亞科其他SFB基因親緣關(guān)系較遠。

參考文獻 References：

[1] CHEN Xue-sen， LI Xian-li， ZHANG Yan-min， WU Shu-jing， SHEN Hong-bo， SHU Huai-rui. Advances in apricot germplasm resources evaluation and genetic breeding [J]. Journal of Fruit Science， 2001， 18（3）： 178-181.

陳學森， 李憲利， 張艷敏， 吳樹敬， 沈洪波， 束懷瑞. 杏種質(zhì)資源評價及遺傳育種研究進展[J]. 果樹學報， 2001， 18（3）： 178-181.

[2] ZHANG Zhao， LIU Ming-zhang， CHEN Wen-jiao， BAO Yan-fen， RE yi-man-ya-sheng. The germplasm of apricot cultivars in Xinjiang[J]. Journal of Fruit Science， 1985，2（3）： 18-23.

張釗， 劉明彰， 陳文椒， 包顏芬， 熱衣曼牙生. 新疆杏的種質(zhì)資源[J]. 果樹科學， 1985，2（3）： 18-23.

[3] MCCLURE B A， HARING V， EBERT P R. Style self-incompatibility gene products of Nicotiana alata are ribonucleases[J]. Nature， 1989， 342： 955-957.

[4] SASSA H， HIRANO H， IKEHASHI H. Self-incompatibility-related RNase in styles of Japanese pear （Pyrus serotina Rehd）[J]. Plant Cell Physiol， 1992， 33： 811-814.

[5] USHIJIMA K， SASSA H， DANDEKAR A M， GRADZIEL T M， TAO R， HIRANO H. Structural and transcriptional analysis of the self-incompatibility locus of almond： identification of a pollen-expression F-box gene with haplotype-specific polymorphism[J]. Plant Cell， 2003， 15： 771-781.

[6] YAMANE H， IKEDA K， USHIJIMA K， SASSA H， TAO R. A pollen-expressed gene for a novel protein with an F-box motif that is very tightly linked to a gene for S-RNase in two species of cherry， Prunus cerasus and P. Avium[J]. Plant Cell Physiol， 2003， 44： 764 -769.

[7] CHENG Jian-hong， BAI Song-ling， HAN Zhen-hai， XU Xue-feng， LI Tian-zhong. Cloning and expression qnalysis of the Self-Incompatibility 9-Haplotype specific F-box genes in cherry （Prunus avium） [J]. Scientia Agricultura Sinica， 2006， 39（5）： 976-983.

成建紅， 白松齡， 韓振海， 許雪峰， 李天忠. 櫻桃自交不親和S9-單元型特異的F-box基因克隆及其表達分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2006， 39（5）： 976-983.

[8] ENTANI T， IWANO M， SHUBA H， CHE F S， ISOGAI A， TAKAYAMA S. Comparative analysis of the self-incompatibility （S-） locus region of Prunus mume： Identification of a pollen-expressed F-box gene with allelic diversity[J]. Genes Cells， 2003， 8： 203 -213.

[9] MCCUBBIN A G， ZUNIGA C， KAO T-h. Construction of a binary bacterial artificial chromosome library of Petunta inflate and the isolation of large genomic fragments liked to the self-incompatibility（S-） locus[J]. Genome， 2000， 43： 820-826.

[10] TAO R， WATARI A， HANADA T， HABU T， YAEGAKI H， YAMAGUCHI M， YAMANE H. Self-compatible peach （Prunus persica） has mutant versions of the S haplotypes found in self-incompatible Prunus species[J] . Plant Mol Biol， 2007， 63（1）： 109-123.

[11] ROMERO C， VILANOVA S， BURGOS L， MARTINEZ-CALVO J， VICENTE M， LLACER G，BADENES M L. Ananlysis of the S-locus structure in Prunus armeniaca L. identification of S-haplotype specific S-RNase and F-box genes[J]. Plant Mol Biol， 2004， 56： 145-157.

[12] TSUKAMOTO T， HAUCK N R， TAO R， JIANG N， IEZZONI A F. Molecular characterization of three non-functional S-haplotypes in sour cherry （Prunus cerasus）[J]. Plant Mol Biol，2006， 62（3）： 371-383.

[13] WU Jun， GU Chao， ZHANG Shao-ling， ZHANG Shu-jun， SONG Hong-feng， ZHAO Xi-ping. Identification and Sequence Analysis of Pollen-sepecific SFB Genes in Self-incompatible Chinese Apricot （Prunus armeniaca）[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2010， 37（8）：1329-1338.

吳俊， 谷超， 張紹鈴， 張樹軍， 宋宏峰， 趙習平. 中國杏自交不親和花粉特異SFB 基因的鑒定與序列分析[J]. 園藝學報， 2010， 37（8）： 1329-1338.

[14] USHIJIMA K， SASSA H， TAO R， YAMANE H， DANDEKAR A M， GRADZIEL T M， HIRANO H. Cloning and characterization of cDNAs encoding S-RNases from almond （Prunus dulcis）： Primary structural features and sequence diversity of the S-RNase in Rosaceae[J]. Mol Gen Genet， 1998， 260： 261-268.

[15] ZHANG Xiao-ming， ZHU Mo， JIANG Li-jie， ZHANG Kai-chun， YAN Guo-hua. A review on the research on the pollen S genes of fruit trees[J]. Journal of Fruit Science， 2005， 22（3）： 261-264.

張曉明， 朱墨， 姜立杰， 張開春， 閆國華. 果樹自交不親和花粉S基因研究進展[J]. 果樹學報， 2005， 22（3）： 261-264.

[16] SONNEVELD T， TOBUTT K R， VAUGHAN S P， ROBBINS T P. Loss of pollen-S function in two self-compatible selections of Prunus avium is associated with deletion/mutation of an S-haplotype-specific F-box gene[J]. Plant Cell， 2005， 17： 37-51.

[17] USHIJIMA K， YAMANE H， WATARI A， KAKEHI E， IKEDA K， HAUCK N R， IEZZONI A F， TAO R. The S haplotype-specific F-box protein gene， SFB， is defective in self-compatible haplotypes of Prunus avium and P. mume[J]. Plant J， 2004， 39： 573-586.

[18] MARCHESE A， BOSKOVIC R I， CARUSO T， RAIMONDO A， CUTULI M， TOBUTT K R. A new self-compatibility haplotype in the sweet cherry ‘Kronio， S50， attributable to a pollen-part mutation in the SFB gene[J]. J Exp Bot， 2007， 58： 4347-4356.

[19] JIANG Xin， CAO Xiao-yan， WANG Da-jiang， FENG Jian-rong， LIU Yue-xia， FAN Xin-ming. Idengtification of self-incompatibility S-RNase genotypes for apricot cultivars in South of Xinjiang area [J]. Journal of Fruit Science， 2012，29（4）： 567-576.

姜新， 曹曉艷， 王大江， 馮建榮， 劉月霞， 樊新民. 南疆杏品種自交不親和S-RNase基因型的鑒定[J]. 果樹學報， 2012，29（4）： 567-576.

[20] WANG Da-jiang， FENG Jian-rong， LIU Yue-xia， JIANG Xin， CAO Xiao-yan， ZHAO Bao-long. Cloning and real-time fluorescence quantitative expression of SFB genes from apricot cultivars in Xinjiang area[J]. Journal of Fruit Science， 2012，29（1）： 60-65.

王大江， 馮建榮， 劉月霞， 姜新， 曹曉艷， 趙寶龍. 新疆杏品種SFB基因的克隆及實時定量表達[J]. 果樹學報， 2012，29（1）： 60 -65.

[21] FENG Jian-rong，CHEN Xue-sen，WU Yan. Extraction of Total RNA from Prunus armeniaca Style[J]. Journal of Agricultural Biotechnology， 2006， 14（5）： 828-829.

馮建榮， 陳學森， 吳燕. 花柱組織總RNA的提取方法[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報， 2006， 14（5）： 828-829.

[22] GUO Chang-kui， LUO Shu-ping， LI Jiang， GAO Qi-ming. Identification and prokaryotic expression of almond AcSFB gene[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2009， 36 （8）： 1215-1220.

郭長奎， 羅淑萍， 李疆， 高啟明. 扁桃AcSFB基因的克隆與原核表達分析[J]. 園藝學報， 2009， 36（8）： 1215-1220.