路則寶，白現(xiàn)廣

（1.楚雄醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，云南楚雄 675005；2.平頂山學(xué)院，河南平頂山 467099）

分子生物學(xué)技術(shù)是21世紀(jì)主導(dǎo)技術(shù)之一，它的發(fā)展大大拓寬和深化了微生物檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，使醫(yī)學(xué)工作者能從DNA、RNA水平上對病原微生物進(jìn)行檢測.其中聚合酶鏈反應(yīng)（plolymerase chain reaction，PCR）作為體外核酸擴(kuò)增技術(shù)在病原微生物的檢測和鑒定、病毒基因的快速診斷、腫瘤基因的篩查等方面廣泛應(yīng)用.核酸探針技術(shù)以其敏感、特異、快速等特點(diǎn)已應(yīng)用于病原菌的檢測.生物芯片（bio- chip）技術(shù)也以其特有的高通量、多信息量、可快速同時(shí)檢測多種待檢樣品的特點(diǎn)在病原菌的檢測方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢[1].現(xiàn)對PCR、核酸探針和生物芯片等分子生物學(xué)技術(shù)在微生物檢驗(yàn)中的最新應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為相關(guān)的研究提供有價(jià)值的參考.

1 PCR技術(shù)

PCR技術(shù)在微生物檢驗(yàn)中最有價(jià)值的應(yīng)用領(lǐng)域就是對病原微生物的檢測.通過在同一反應(yīng)管中同時(shí)加上多種病原微生物的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，可用于多種病原微生物的同時(shí)檢測或鑒定出是哪種病原微生物感染[2].我國20世紀(jì)90 年代中期，PCR 技術(shù)已經(jīng)廣泛地用于檢測感染性病原微生物，如人類免疫缺陷病毒（HIV），肝炎病毒（HBV）、HCV、性病致病菌等病原菌的檢驗(yàn)[3]，現(xiàn)在PCR 技術(shù)也已經(jīng)應(yīng)用于檢測鑒定分枝桿菌和檢測結(jié)核桿菌耐藥基因[4]，近幾年來令全球恐慌的禽流感的致病病毒的檢測也采用了PCR手段[5].

PCR技術(shù)具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，只要樣本中有一個(gè)病原體存在，在理論上，通過PCR就可以檢測到.PCR技術(shù)不受混合標(biāo)本的影響，可輕易從含有大量正常菌群的標(biāo)本中鑒定病原菌[6]，而且對于一些不易分離培養(yǎng)，生長緩慢或不能人工培養(yǎng)，血清學(xué)方法不能明確或者檢測靈敏度底的病原菌，比如分支桿菌、幽門螺桿菌、支原體衣原體、螺旋體、大多數(shù)病毒等，應(yīng)用PCR技術(shù)則具有獨(dú)特的優(yōu)勢[7]，因此PCR技術(shù)在病原微生物檢測和鑒定方面有著廣闊的應(yīng)用前景.

當(dāng)然常規(guī) PCR技術(shù)也存在很多的問題，如出現(xiàn)假陽性、形成引物二聚體、傳統(tǒng)的PCR技術(shù)一次擴(kuò)增只能檢測一種微生物、RNA病毒的PCR檢測操作繁瑣，中間污染環(huán)節(jié)多，易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果等.為了彌補(bǔ)上面這些不足，一些新的PCR技術(shù)逐漸衍生出來并被用于實(shí)踐，如熱啟動(dòng)PCR、巢式PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、多重PCR、通用引物PCR、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、隨機(jī)引物DNA 多態(tài)性擴(kuò)增（RAPD）、限制性長度多態(tài)性分析（RFLP）、實(shí)時(shí)熒光PCR（real-time PCR）等[8].

綜上，PCR技術(shù)將來有可能完全改變微生物檢驗(yàn)的發(fā)展，使微生物檢驗(yàn)發(fā)展為分子水平上的確診，而不再局限于外部形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理特性等一般檢驗(yàn).

2 核酸探針技術(shù)

核酸探針是指帶有標(biāo)記的特異DNA片段，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則，核酸探針能特異的與目的DNA雜交，最后再用特定的方法測定標(biāo)記物.探針標(biāo)記的方式分為放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記，目前用的較多的是非放射性標(biāo)記，主要有生物素標(biāo)記、地高辛標(biāo)記、免疫標(biāo)記、熒光素標(biāo)記等幾種，具有直觀、準(zhǔn)確的特點(diǎn)[9].應(yīng)用較廣泛的生物素-抗生物素蛋白系統(tǒng)標(biāo)記的探針已在沙門氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌及乙型肝炎病毒檢測中得到應(yīng)用.

目前核酸探針在微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用主要在以下幾個(gè)方面：用于檢測無法培養(yǎng)、不能進(jìn)行生化鑒定、產(chǎn)生不可觀察的微生物產(chǎn)物以及缺乏診斷抗原等病原體的檢測；用于檢測病毒病，如檢測肝炎病毒；用于流行病學(xué)調(diào)查研究，區(qū)分有毒和無毒菌株；檢測細(xì)菌內(nèi)抗藥基因；用于分析食品是否會(huì)被某些耐藥菌株污染，判定食品污染的特性，比如Yasuhara[10]等以啤酒腐敗菌中厭氧菌Pectinatus的16S rRNA為靶分子設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，并用熒光標(biāo)記檢測啤酒是否被這種菌污染.

3 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)是20 世紀(jì)90 年代中期以來影響深遠(yuǎn)的科技進(jìn)展之一，是融合了微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)等為一體的高度交叉的尖端新技術(shù)[11].生物芯片根據(jù)反應(yīng)體系狀態(tài)的不同，可分為固相芯片和液相芯片，根據(jù)檢測對象的不同又可分為基因芯片和蛋白芯片.液相芯片較傳統(tǒng)的固相芯片相比主要優(yōu)點(diǎn)在于：檢測準(zhǔn)確度高，信息質(zhì)量穩(wěn)定，檢測結(jié)果可重復(fù)性好，檢測用時(shí)短以及操作簡便.因此液相芯片在生命科學(xué)研究的諸多領(lǐng)域，比如病原菌感染的檢測方面，有著廣闊的應(yīng)用前景.現(xiàn)在液相芯片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因檢測、細(xì)胞因子檢測、蛋白質(zhì)分析和藥物檢測等，極大的推動(dòng)了臨床檢測和科學(xué)研究的快速發(fā)展[12].

基因芯片因其可快速、準(zhǔn)確、高效的地顯示病原體的遺傳信息，已廣泛的應(yīng)用于基因序列的分析、病原微生物感染的快速診斷、病原菌變異及耐藥機(jī)制的研究，以及基因分型、分子流行病學(xué)調(diào)查和抗感染藥物的研制等[13].基因芯片技術(shù)的興起也給微生物檢測帶來了新的革命，近年來已有此技術(shù)應(yīng)用于大腸埃希菌、痢疾志賀菌、傷寒沙門菌檢測的報(bào)道[14]，應(yīng)用基因芯片技術(shù)還可鑒定分枝桿菌菌種和檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥基因[15].隨著基因芯片技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，以及眾多的微生物全基因序列的測定，在將來人們或許可以在一張芯片上檢測出幾乎所有的病原菌.

綜上，生物芯片技術(shù)與傳統(tǒng)微生物檢測方法相比，樣品需求量少，檢測效率高，因此在微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域有著廣闊的發(fā)展和應(yīng)用前景.

4 其它分子生物技術(shù)在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用

在食品微生物檢驗(yàn)中，ATP生物發(fā)光法可用于生乳中細(xì)菌的快速檢測[16]，這種方法具有準(zhǔn)確、便利、快速的優(yōu)點(diǎn)，能夠在 5～10 min內(nèi)檢測出牛奶中細(xì)菌的數(shù)量.

快速檢測病原菌的自動(dòng)分析系統(tǒng)也越來越多，比如Dupont de Nemours公司生產(chǎn)的Ribo PrinterTMDNA指紋圖譜自動(dòng)分析系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)得到的核酸圖譜與其他貯存的核酸堿基序列進(jìn)行比較，通過核酸匹配分析可以對微生物進(jìn)行鑒定.

另外，氣相色譜和高效液相色譜的分析也應(yīng)用到致病微生物的檢測中，主要是依據(jù)不同病原體的化學(xué)組成或所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物各異，利用上述色譜檢查可直接分析各種體液中的細(xì)菌代謝產(chǎn)物、細(xì)胞中的脂肪酸、蛋白、氨基酸、多肽、多糖等，以確定病原微生物的特異性化學(xué)標(biāo)志成分，協(xié)助病原診斷和檢測，其中以氣相色譜應(yīng)用較多，該法簡單、快速[17].

5 分子生物學(xué)技術(shù)在微生物檢驗(yàn)應(yīng)用中的發(fā)展趨勢

分子生物學(xué)技術(shù)在微生物檢驗(yàn)應(yīng)用中的發(fā)展趨勢主要體現(xiàn)在以下三個(gè)方面：一是朝著高度特異性、高度靈敏性和高度自動(dòng)化的方向發(fā)展；二是會(huì)進(jìn)一步與其它學(xué)科技術(shù)交叉融合，打破各技術(shù)之間的局限，從而將檢驗(yàn)的范圍擴(kuò)展；三是新的分子生物學(xué)技術(shù)還將會(huì)不斷的產(chǎn)生，其在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用也將越加廣泛.

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