張怡 譚樹(shù)華

(1.中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子生物學(xué)教研室 江蘇南京 210009;2.中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 江蘇南京 210009)

在利用基因工程進(jìn)行蛋白的生產(chǎn)時(shí),通常使用構(gòu)建融合蛋白的方法,最常使用的融合蛋白標(biāo)簽包括大腸桿菌的麥芽糖結(jié)合蛋白MBP,谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST,組氨酸殘基組成的融合標(biāo)簽TrxHIS等。借助于融合蛋白的特征和性質(zhì),能夠大大簡(jiǎn)便蛋白的表達(dá)純化、鑒定及檢測(cè)過(guò)程。目前,通過(guò)構(gòu)建融合蛋白進(jìn)行表達(dá)在原核表達(dá)體系以及真核表達(dá)體系均有較廣的應(yīng)用。

當(dāng)重組蛋白作為基因工程藥品及其他一些用途時(shí),由于融合標(biāo)簽是否會(huì)影響蛋白的性質(zhì)和功能還有待考察研究,所以一般要求目標(biāo)產(chǎn)物必須像天然蛋白質(zhì)一樣的完整產(chǎn)物,而不能以融合蛋白形式存在。因此,一般需要對(duì)融合表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行產(chǎn)物后加工,即對(duì)融合蛋白在體外實(shí)施特定氨基酸序列的切割和斷裂,獲得完整的目的產(chǎn)物。目前最為常用的裂解方法有:(1)化學(xué)法:如用溴化氰斷裂;(2)蛋白酶法:如用凝血酶,活化的Xa因子或腸激酶特異性裂解。由于溴化氰為劇毒化合物,而且其切割識(shí)別位點(diǎn)為Met,因此實(shí)用性不強(qiáng)。用蛋白酶進(jìn)行切割時(shí),要求工具酶:①能夠識(shí)別并裂解特定的氨基酸序列;②為避免雜質(zhì)蛋白酶引發(fā)不必要的裂解反應(yīng),需要高純度的工具蛋白酶。但是目前常用的工具蛋白酶成本較高,價(jià)格昂貴,不利于放大生產(chǎn)。這樣,就給IMPACT-TWIN蛋白純化系統(tǒng)的應(yīng)用提供了廣闊的空間。

IMPACT-TWIN系統(tǒng)包括pTWIN1,pTWIN2兩個(gè)表達(dá)載體,他們都使用了經(jīng)改造過(guò)的Ssp DnaB內(nèi)含肽作為intein1。兩者的區(qū)別在于使用了不同的intein2,pTWIN1使用了改造后的Mxe GyrA內(nèi)含肽作為intein2;而pTWIN2使用的是Mth RIR1內(nèi)含肽。Intein是一個(gè)蛋白剪接元件,類(lèi)似于基因組中的內(nèi)含子intron在RNA剪接中的作用,intein在較低的溫度和還原條件下會(huì)發(fā)生自身介導(dǎo)的末端裂解反應(yīng)。此外IMPACT-TWIN系統(tǒng)另外一個(gè)重要元件幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白域(CBD),CBD源于Bacillus circulans WL-2的幾丁質(zhì)酶A1的C端片段。由于CBD可高度特異地結(jié)合于幾丁質(zhì)上,可用來(lái)作為融合蛋白純化過(guò)程中的親和標(biāo)簽(Watanab et al.,1994;Chong et al.,1997;Xu et al.2000)。

IMPACT-TWIN系統(tǒng)的表達(dá)載體中,在多克隆位點(diǎn)兩端都設(shè)計(jì)了一段intein和CBD的融合基因,如下:幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白域(CBD)-intein1-MCS-intein2-幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白域(CBD)。所以有3種融合方法,即目的蛋白的N-端,C-端或者N-端和C-端可同時(shí)融合上幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白域(CBD)-intein。目的蛋白的N端連接Ssp DnaB自剪切元件時(shí),可以通過(guò)改變pH和溫度,而不需要使用任何化學(xué)試劑。Intein加到目的蛋白C端時(shí),他們的的純化是利用硫醇誘導(dǎo)Mxe GyrA或者M(jìn)th RIR1intein的剪切。

pTWIN質(zhì)粒利用T7啟動(dòng)子控制融合基因的表達(dá)。在沒(méi)有IPTG誘導(dǎo)表達(dá)時(shí),阻遏物結(jié)合到lac操縱子序列上,融合基因的表達(dá)被抑制。pTWIN載體有氨芐抗性,可以使宿主菌擁有氨芐抗性。

蛋白表達(dá)純化系統(tǒng)IMPACT-TWIN中,幾丁質(zhì)蛋白結(jié)構(gòu)域(CBD)、蛋白自剪接元件(intein)、目的蛋白連接形成融合基因,在宿主細(xì)胞中表達(dá),融合蛋白可利用CBD與幾丁質(zhì)親和層析柱進(jìn)行結(jié)合,此時(shí),再利用在特定的條件下誘導(dǎo)內(nèi)含肽的肽鍵裂解活性,目的蛋白與CBD及內(nèi)含肽分開(kāi),從親和層析柱釋放出來(lái),而內(nèi)含肽與CBD仍結(jié)合在幾丁質(zhì)純化介質(zhì)上,達(dá)到了單柱分離純化的目的。經(jīng)過(guò)分析,此法得到的蛋白與天然蛋白一致,不會(huì)殘留或缺失氨基酸,也避免了后續(xù)實(shí)驗(yàn)中蛋白酶與目的蛋白分離純化的麻煩,是一種高效率,低成本,安全性高的蛋白質(zhì)分離純化系統(tǒng)。

IMPACT-TWIN分離純化系統(tǒng)已在多領(lǐng)域得到應(yīng)用。將CBD連接到intein的N端,突變的CBD序列連接到intein C端。40mM MESNA誘導(dǎo)過(guò)夜,intein N端發(fā)生剪切,CBD的C端則出現(xiàn)了一個(gè)硫酯鍵,N端含有半胱氨酸的抗體就可連接到CBD的C端,借助于幾丁質(zhì)柱材便可實(shí)現(xiàn)純化過(guò)程(Sun L,Ghosh I,Xu M Q.Journal of immunological methods,2003,282(1):45-52.)。維他命D受體基因克隆到表達(dá)載體pTWIN1中,通過(guò)改變pH的方法,使目的蛋白N端的intein發(fā)生自剪切反應(yīng),釋放出來(lái)維他命D受體蛋白(Collins E D,Espinoza A,Le L T N,et al.The Journal of steroid biochemistry and molecular biology,2010,121(1):121-123.)。IMPACT-TWIN蛋白表達(dá)純化系統(tǒng)克服了有抗菌活性的β防御素表達(dá)困難的缺陷,提供了一個(gè)方便經(jīng)濟(jì)的表達(dá)方式,實(shí)現(xiàn)了其在臨床上應(yīng)用的可能(Zhao Y,Diao H,Ni Z,et al.Cellular and Molecular Life Sciences,2011,68(4):697-708.)。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP),自剪接元件intein,可以定位于細(xì)胞膜的冰核蛋白(INP)構(gòu)成的融合蛋白,在室溫pH10.0 Tris–HCl中,由于intein的自剪切,EGFP被釋放出來(lái),經(jīng)離心即可獲得目的蛋白。此過(guò)程不必涉及破菌過(guò)程,可用于重組蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)(Wu J Y,Tsai T Y,Liu T T,et al.,2011,54(3):158-163.)。