劉 冰綜述，陳華根審校（四川省成都市新都區(qū)人民醫(yī)院 610500）

結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌所致的一種古老傳染病，它的傳播與有記載的人類文明史同步。全球有1／3的人感染結(jié)核分枝桿菌，有2 000萬活動性結(jié)核病患者，每年新發(fā)病例900萬人，有300萬人死于結(jié)核病。中國是結(jié)核分枝桿菌高感染率國家，僅次于印度，居世界第二，感染率44.5%，有活動性肺結(jié)核患者451萬，每年有12.7萬人死于結(jié)核病。由于其治療費(fèi)用高、治愈率低、病死率高，世界衛(wèi)生組織已將結(jié)核病、艾滋病和瘧疾一起列為人類最主要?dú)⑹?。結(jié)核病不僅損害個人健康，影響生命質(zhì)量，而且還會對患者家庭造成沉重的精神與經(jīng)濟(jì)壓力，從而加重社會負(fù)擔(dān)，現(xiàn)已成為全球性公共衛(wèi)生問題［1］。結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷，對于結(jié)核病的預(yù)防和治療具有重要作用。涂片染色鏡檢和培養(yǎng)技術(shù)是迄今應(yīng)用最為廣泛、經(jīng)典的結(jié)核病診斷技術(shù)［2］，但存在敏感性低、檢測周期長、對肺外結(jié)核和越發(fā)增多的菌陰肺結(jié)核檢測局限等特點(diǎn)。分子生物學(xué)技術(shù)是新興的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，具有快速、靈敏、特異等特點(diǎn)，特別是菌種鑒定和耐藥基因突變檢測，被認(rèn)為是實(shí)驗(yàn)室診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，必將成為結(jié)核分枝桿菌檢測的常規(guī)方法，但存在設(shè)備和技術(shù)要求高，許多具體方法效能還有待臨床大樣本驗(yàn)證［3］的缺點(diǎn)。免疫學(xué)檢測技術(shù)也是實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)核病廣泛應(yīng)用的技術(shù)，從早期的結(jié)核菌素試驗(yàn)，到現(xiàn)在的蛋白印跡和蛋白芯片技術(shù)，有適合基層實(shí)驗(yàn)室使用的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫滲濾和層析技術(shù)，也有適合各級實(shí)驗(yàn)室使用的蛋白印跡試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT），各種免疫學(xué)檢測技術(shù)正逐步在實(shí)驗(yàn)室開展。免疫學(xué)檢測的關(guān)鍵是制備選擇特異的免疫原。

1 常用免疫原

1.1 舊結(jié)核菌素（OT）和純蛋白衍生物（PPD） OT是結(jié)核分枝桿菌在甘油肉湯中培養(yǎng)后，經(jīng)加熱、過濾和濃縮處理而獲得的復(fù)合抗原；PPD是在用三氯醋酸沉淀培養(yǎng)濾液后的純化物。牛分枝桿菌經(jīng)13年230代傳代培養(yǎng)后獲得的減毒活疫苗－卡介苗（BCG）含OT和PPD抗原?，F(xiàn)在常用PPD作皮膚試驗(yàn)，以此選擇接種對象和判定接種效果、診斷嬰幼兒結(jié)核病、未接種對象結(jié)核分枝桿菌感染流行病學(xué)調(diào)查、測定腫瘤患者的細(xì)胞免疫功能，也可用PPD檢測結(jié)核分枝桿菌抗體。缺點(diǎn)是多種分枝桿菌皆含PPD，敏感性和特異性較低，難以區(qū)分顯性感染還是陰性感染、肺內(nèi)外感染以及BCG免疫。

1.2 早期分泌性靶抗原6（ESAT－6） 從結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中純化分離的低分子蛋白，相對分子質(zhì)量為6×103，含95個氨基酸。免疫原性較強(qiáng)，是參與結(jié)核病免疫調(diào)節(jié)的重要抗原。對結(jié)核分枝桿菌呈現(xiàn)免疫應(yīng)答，對非結(jié)核分枝桿菌多無免疫應(yīng)答，因此可作為免疫檢測重要抗原和新型疫苗備選抗原，用作結(jié)核菌實(shí)驗(yàn)室檢測和結(jié)核病防治［4］。

1.3 CFP10 同ESAT－6屬同一家族，分離于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液，作用于T細(xì)胞，誘導(dǎo)皮膚遲發(fā)性超敏反應(yīng)，刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生特異性干擾素γ。作為免疫學(xué)檢測抗原，特異性高，敏感性低，結(jié)合38KD蛋白，可以提高菌陰結(jié)核病檢測敏感性［5］。

1.4 38KD蛋白（Ag5，Pst－1，Pab） 1986年由 Young等［6］首次制備，含特異的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞抗原決定簇，是結(jié)核桿菌的主要免疫原，對結(jié)核病的診斷具有較高的特異性和敏感性，可區(qū)分結(jié)核病患者和BCG接種后陽性者。

1.5 Ag85復(fù)合體 是一組具有較強(qiáng)免疫活性的分枝桿菌分泌性蛋白，至少包括Ag85A、Ag85B、Ag85C3種蛋白成分，可在所有的分枝桿菌菌株中引起廣泛的交叉反應(yīng)。Ag85B（抗原6、MPB／MPT59）是結(jié)核桿菌的主要分泌蛋白，診斷上優(yōu)于Ag85A和Ag85C。Ag85的增高，對活動性結(jié)核病判定具有輔助診斷價(jià)值［7］。

1.6 MPT64 是一種24KD的結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白，只存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中，大多數(shù)BCG菌株對MPT64皮膚試驗(yàn)不反應(yīng)，作為皮膚試驗(yàn)診斷蛋白優(yōu)于PPD［8］。

1.7 A60抗原 是一種脂－多糖－蛋白復(fù)合物，OT和PPD的主要成分，具有強(qiáng)免疫原性，激發(fā)特異性免疫應(yīng)答和遲發(fā)性超敏反應(yīng)，對肺外結(jié)核診斷具有一定價(jià)值。

1.8 14KD蛋白 含結(jié)核桿菌特異性的B抗原表位，誘導(dǎo)特異性體液免疫應(yīng)答，感染早期特異性抗體升高。

1.9 TB4 是結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)毒株H37RV多肽，只與少數(shù)分枝桿菌有交叉免疫反應(yīng)，作為結(jié)核菌感染診斷有較高的靈敏度和特異性。

1.10 LAM 即脂阿拉伯甘露聚糖抗原，是分枝桿菌特有的細(xì)胞壁成分，正生長的結(jié)核菌能大量產(chǎn)生，可能是A60抗原的重要成分。對判定活動性結(jié)核、菌陰結(jié)核和其他肺外結(jié)核有診斷意義［9－10］。

雖然各種結(jié)核分枝桿菌免疫原不斷發(fā)現(xiàn)，但沒有任何一種抗原能檢測結(jié)核病患者血清中所有結(jié)核抗體，且在分枝桿菌中存在不同程度的交叉反應(yīng)性［11］。利用多個相關(guān)抗原聯(lián)合檢測，可以提高免疫學(xué)檢測的敏感性和特異性，滿足結(jié)核病診斷的各種需求。朱中元等［12］報(bào)道，以38KD、蛋白16和LAM，利用蛋白芯片進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)，取得較理想的快速診斷效果。杜鳳嬌等［13］報(bào)道，用 ESAT－6和 CFP－10融合蛋白刺激，利用ELISPOT和流式細(xì)胞術(shù)檢測干擾素γ，對結(jié)核性胸膜炎的診斷有較高的敏感度和特異度。劉忠華等［14］報(bào)道，CFP－10、MPT48和TB8.4融合蛋白具有很好的免疫原性，可以提高結(jié)核抗體檢測的特異度和敏感度。因此，利用多個純化的特異抗原，聯(lián)合檢測，可顯著提高檢測的敏感性，是結(jié)核病免疫檢測今后研究和應(yīng)用的方向。

2 主要免疫學(xué)檢測技術(shù)

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 利用包被在微孔上的已知抗原（抗體）和待測抗體（抗原）及酶標(biāo)記抗原（抗體）反應(yīng)，洗滌去多余的反應(yīng)物，催化底物顯色，根據(jù)呈色強(qiáng)弱判定待測物有無（多少）。通常檢測步驟包括：加樣、溫育、洗滌、顯色、比色、結(jié)果判斷和報(bào)告。該檢測技術(shù)檢測結(jié)核抗體具有快速、簡便、準(zhǔn)確、價(jià)廉的特點(diǎn)，臨床應(yīng)用廣泛。

2.2 金標(biāo)免疫滲濾法和金標(biāo)免疫層析法 均屬固相膜免疫測定，不同的是前者液體在硝酸纖維素膜上是直向穿流，后者是橫流。無需特殊儀器，易于判讀，簡便快速、試劑穩(wěn)定，臨床應(yīng)用廣泛。

2.3 免疫印跡技術(shù) 是電泳技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，常用作抗體確認(rèn)試驗(yàn)。對活動性結(jié)核病，尤其是菌陰肺結(jié)核的診斷具有很高的價(jià)值。但該方法繁瑣，成本較高，常規(guī)檢測應(yīng)用較少。

2.4 蛋白芯片技術(shù) 將多種結(jié)核分枝桿菌特異抗原聯(lián)合，借助微陣列高通量平臺，檢測結(jié)核特異性抗體。具有操作簡便快速、敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但芯片制作工藝需完善，需要儀器判讀，臨床推廣還需時日。

2.5 ELISPT 是近年來應(yīng)用在結(jié)核病免疫檢測的新興技術(shù)，具有較高的靈敏度和特異性，但操作繁瑣，推廣困難。

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