王敏娟

（寶雞文理學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，陜西 寶雞721013）

DNA屬于生物聚合物當(dāng)中的一類，是最重要的遺傳信息載體。20世紀(jì)90年代初，人們發(fā)現(xiàn)一部分DNA分子也表現(xiàn)出催化活性，稱之為脫氧核酶（DNA酶，DNAzyme）。目前，DNA酶和適體統(tǒng)一被稱為功能化的DNA，可以通過(guò)體外篩選、擴(kuò)增技術(shù)得到。

雖然DNA酶有催化功能，但是當(dāng)它單獨(dú)存在時(shí)，其催化作用很弱；只有在可與其特異性結(jié)合的輔助因子共存時(shí)，才能激活DNA酶的活性而表現(xiàn)出催化性能，這些輔助因子包括氨基酸、核酸、金屬離子和小的有機(jī)分子等?；诖嗽?，DNA酶被作為識(shí)別物質(zhì)廣泛應(yīng)用于一系列金屬離子（如 Hg2＋、Cu2＋、Pb2＋等）的識(shí)別和檢測(cè)。

1 DNA酶的特點(diǎn)

（3）與蛋白質(zhì)相比，DNA酶發(fā)生多次的復(fù)性、變性之后，其結(jié)合力或者活性仍然不受影響，因此，可以在相當(dāng)苛刻的條件下使用和儲(chǔ)存。

（4）DNA 酶可以用于光纖和微陣列技術(shù)［3，4］，可以用于實(shí)時(shí)或者多種金屬離子的同時(shí)檢測(cè)。

2 DNA酶的作用機(jī)理

與金屬離子特異性識(shí)別的DNA酶由兩部分組成：第一部分是特異性識(shí)別金屬離子的環(huán)狀部分；第二部分是與底物鏈雜交的部分。當(dāng)?shù)孜镦溑c酶鏈雜交之后，如果有與酶鏈特異性識(shí)別的金屬離子存在，酶鏈就會(huì)被激活，底物鏈的rA處被水解而斷裂。因此，DNA酶作為生物識(shí)別物質(zhì)廣泛應(yīng)用于多種金屬離子的檢測(cè)。

DNA酶作為生物探針具有以下特點(diǎn)：

（1）DNA酶的制備不依賴于動(dòng)物和細(xì)胞，而是可以通過(guò)體外篩選或指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)來(lái)得到，而且其序列一旦確定，就可以通過(guò)化學(xué)的方法進(jìn)行合成。因此，同批生產(chǎn)的DNA酶幾乎沒有批間誤差，而且組成確定，純度高。

（2）DNA酶是單鏈的DNA序列，比較容易合成，大約在1～2d內(nèi)即可完成，而且比RNA的合成便宜。在生理?xiàng)l件下，DNA的穩(wěn)定性比蛋白質(zhì)高1000倍，比RNA高10萬(wàn)倍［1］。近期發(fā)現(xiàn)，DNA酶經(jīng)常以球狀蛋白的形式存在［2］，所以不易被核酸內(nèi)切酶識(shí)別。

3 DNA酶?jìng)鞲衅髟诠鈱W(xué)分析中的研究進(jìn)展

金屬中毒，是指人體內(nèi)某種金屬的含量過(guò)多而引起的慢性或急性中毒，并非過(guò)量攝入有害的金屬離子才會(huì)導(dǎo)致人體中毒，人體需要的金屬離子攝入過(guò)量也會(huì)導(dǎo)致金屬中毒。通常情況下，重金屬一旦攝入人體將無(wú)法排出體外。因此如何快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)某種金屬離子是否超標(biāo)已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。

目前，金屬離子的檢測(cè)方法主要有原子吸收光譜法［5］、電 感 耦 合 等 離 子 體 質(zhì) 譜 法［6－8］、陽(yáng) 極 溶 出 伏 安法［9，10］、毛細(xì)管電泳法［11］等，這些方法 大多需要精密的儀器和熟練的操作人員，而且樣品需要預(yù)處理，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)金屬離子的實(shí)時(shí)檢測(cè)。因此人們建立了基于DNA酶的生物傳感方法用于檢測(cè)金屬離子。下面就主要介紹DNA酶在光學(xué)傳感器中的應(yīng)用進(jìn)展。

3．1 基于DNA酶的熒光傳感器

熒光傳感器的構(gòu)建是基于分子識(shí)別物質(zhì)與目標(biāo)物作用前后體系熒光信號(hào)的變化來(lái)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)的。早在2000年，Li等［12］就篩選出了與Pb2＋特異性結(jié)合的DNA酶（17E），同時(shí)構(gòu)建了檢測(cè)Pb2＋的熒光傳感器。在底物鏈（17DS）的5′端標(biāo)記了熒光物質(zhì)TAMRA，在酶鏈（17E）的3′端標(biāo)記了猝滅劑 Dabcyl，當(dāng)標(biāo)記有熒光物質(zhì)的底物鏈單獨(dú)存在于溶液中時(shí)，體系的熒光信號(hào)很強(qiáng)；當(dāng)加入酶鏈之后，由于底物鏈和酶鏈雜交成雙螺旋結(jié)構(gòu)，使得熒光物質(zhì)和猝滅物質(zhì)間發(fā)生了熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），TAMRA的熒光被猝滅，體系熒光信號(hào)大大減弱；向體系中加入Pb2＋后，Pb2＋作為酶的輔助因子，使得酶的活性被激活，底物鏈在切割點(diǎn)被切斷，熒光猝滅現(xiàn)象被消除，TAMRA的熒光信號(hào)恢復(fù)，體系熒光信號(hào)增強(qiáng)，此方法在4℃下的檢出限為10nmol·L－1。雖然此方法能夠高靈敏度、高選擇性地檢測(cè)Pb2＋，但是必須在4℃下進(jìn)行，如果溫度升高到室溫就會(huì)導(dǎo)致底物鏈從酶鏈上解旋下來(lái)而產(chǎn)生過(guò)高的背景信號(hào)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，Liu等［13］建立了一種基于分子內(nèi)和分子間同時(shí)猝滅的雙猝滅新型熒光檢測(cè)方法來(lái)降低背景信號(hào)，原理如圖1所示。

圖1 基于DNA酶檢測(cè)Pb2＋的單猝滅（A）與雙猝滅（B）熒光傳感器對(duì)比Fig．1 Comparison of the single－（A）and double－quencher（B）DNAzyme－based Pb2＋ sensor designs

由圖1可看出，雙猝滅效應(yīng)對(duì)高的背景信號(hào)產(chǎn)生了明顯的抑制作用，并且可以在較寬的溫度范圍內(nèi)對(duì)Pb2＋進(jìn)行檢測(cè)且不影響選擇性。2005年，Swearingen等［14］又建立了非均相檢測(cè)Pb2＋的熒光法。將一端修飾有猝滅劑、另一端修飾有巰基的酶鏈（HS－17E－Dy）通過(guò)巰基自組裝固定到金表面，再與標(biāo)記有熒光物質(zhì)的底物鏈（17DS－Fl）雜交，不存在Pb2＋時(shí)，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)較接近，熒光信號(hào)被猝滅；與Pb2＋反應(yīng)后，底物鏈被切斷，熒光信號(hào)恢復(fù)，同樣根據(jù)加入Pb2＋前后體系熒光信號(hào)的變化來(lái)對(duì)Pb2＋進(jìn)行定量檢測(cè)。與均相熒光法相比，非均相的檢測(cè)方法使得固定在金表面的酶鏈可以再生和長(zhǎng)期保存，而且檢出限（1nmol·L－1）比均相檢出限降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)。

雖然之前構(gòu)建的基于DNA酶的金屬離子傳感器響應(yīng)速度快，但是須對(duì)酶鏈或者底物鏈進(jìn)行標(biāo)記，因而對(duì)酶的活性有一定的影響，且成本較高。

2009年，Xiang等［15］將dSpacer位點(diǎn)引入到傳感器的構(gòu)建當(dāng)中，他們?cè)贒NA雙鏈區(qū)的酶鏈上引入了一個(gè)dSpacer位點(diǎn)，以熒光小分子2－氨基－5，6，7－三甲基－1，8－萘啶（ATMND）為信號(hào)物質(zhì)，建立了基于DNA酶的無(wú)標(biāo)記型熒光法用于檢測(cè)Pb2＋。單獨(dú)的ATMND溶液的熒光信號(hào)很強(qiáng)，但是當(dāng)它嵌入到有dSpacer位點(diǎn)的雙鏈中形成配合物時(shí)，熒光信號(hào)被猝滅。Pb2＋的存在使得酶鏈被激活而將底物鏈切斷，雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，小分子被釋放出來(lái)，熒光信號(hào)增強(qiáng)，在優(yōu)化的條件下，這種無(wú)標(biāo)記的方法對(duì)溶液中4nmol·L－1的Pb2＋也能產(chǎn)生特異性的響應(yīng)。

2010年，Zhang等［16］又將高猝滅效率的分子信標(biāo)模型和酶催化檢測(cè)Pb2＋模型聯(lián)合起來(lái)，建立了一種檢測(cè)Pb2＋的催化分子信標(biāo)（CAMB）新模型。此方法與前面的方法相比，有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：第一，催化分子信標(biāo)背景信號(hào)低，改變了信噪比，靈敏度比直線型的底物探針模型高；第二，分子信標(biāo)的猝滅效率高，使得在操作中可以用比酶鏈濃度較大的底物鏈來(lái)達(dá)到信號(hào)放大的目的；第三，酶鏈無(wú)需修飾猝滅物質(zhì)來(lái)起猝滅的作用，可以用來(lái)傳感一系列的目標(biāo)物（金屬離子或有機(jī)分子）。該法檢測(cè)限（600pmol·L－1）較基于DNA酶的Pb2＋檢測(cè)方法更低。

隨后，Carmi等［17，18］和 Liu等［19］篩選出了與 Cu2＋特意性識(shí)別的DNA酶。Liu等［20］采用降低背景信號(hào)的雙猝滅方法，構(gòu)建了檢測(cè)Cu2＋的熒光傳感器，該傳感器可以對(duì)溶液中不低于35nmol·L－1（2．3ppb）的Cu2＋進(jìn)行檢測(cè)，且響應(yīng)速度特別快，在2～4min內(nèi)就可以完成檢測(cè)。此外，Liu等［21，22］還運(yùn)用DNA酶構(gòu)建了一系列用于檢測(cè)其它金屬離子（如Uo2＋、Hg2＋）的熒光傳感器。

3．2 基于DNA酶的光度傳感器

光度傳感器的構(gòu)建是基于分子識(shí)別物質(zhì)與目標(biāo)物作用前后體系吸光度的變化進(jìn)行定量檢測(cè)，或者根據(jù)加入目標(biāo)物前后，體系最大吸收波長(zhǎng)的變化進(jìn)而引起溶液顏色的變化，來(lái)進(jìn)行目視檢測(cè)，即所謂的比色法。

Liu等［22］在這方面也進(jìn)行了一系列的工作，將之前構(gòu)建的用于檢測(cè)Pb2＋的熒光傳感器模型改為光度傳感器［23］。該光度傳感器是將底物鏈兩端延伸，使得延伸的部分正好與自組裝在納米金粒子（13nm）上的單鏈DNA雜交，然后與酶鏈雜交，在沒有與Pb2＋作用之前，延伸的底物鏈將溶液中修飾有單鏈DNA的納米金粒子連在一起，納米金團(tuán)聚，膠體溶液由酒紅色變?yōu)樗{(lán)色；與Pb2＋作用后，底物鏈被水解斷裂，納米金再度分散到溶液中，顏色由藍(lán)色又變回酒紅色，從而可根據(jù)顏色和吸光度的變化來(lái)檢測(cè)Pb2＋。

2008年，Lee等［23］采用檢測(cè)Pb2＋的比色法模型，構(gòu)建了基于DNA酶的標(biāo)記型和非標(biāo)記型光度傳感器用于檢測(cè)UO，原理如圖2所示。

圖2 基于DNA酶的光度傳感器用于檢測(cè)UO的研究Fig．2 Scheme of labeled and lable－free colorimetric sensors based on Au nanoparticle in the absence and presence of UO

3．3 基于DNA酶的電化學(xué)發(fā)光傳感器

近年來(lái)，電化學(xué)發(fā)光分析方法因高的靈敏度和可以重復(fù)多次檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)也受到了研究者的關(guān)注。Ma等［24］以釕聯(lián)吡啶為電化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，構(gòu)建了信號(hào)增強(qiáng)型電化學(xué)發(fā)光DNA酶?jìng)鞲衅饔糜跈z測(cè)Pb2＋的方法。將3′端標(biāo)有釕聯(lián)吡啶的與底物鏈雜交好的DNA酶固定在石墨電極的表面，在沒有加入目標(biāo)物Pb2＋之前，酶鏈與底物鏈以雙螺旋結(jié)構(gòu)存在，由于雙螺旋結(jié)構(gòu)有一定的剛性，使得釕聯(lián)吡啶與電極表面的距離增大；加入Pb2＋后，Pb2＋將底物鏈切斷，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)被打開，從而使得釕聯(lián)吡啶與電極的距離縮小，電化學(xué)發(fā)光信號(hào)增強(qiáng)，根據(jù)體系電化學(xué)發(fā)光信號(hào)的變化對(duì)目標(biāo)物Pb2＋進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)限為1．4pmol·L－1。此方法也可以用于其它金屬離子的檢測(cè)。

4 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，光學(xué)分析法由于靈敏度高、操作簡(jiǎn)單和檢測(cè)費(fèi)用低等特點(diǎn)而得到了迅速的發(fā)展。由于DNA酶合成較便宜、性質(zhì)穩(wěn)定、易于儲(chǔ)存，而且在金屬離子的存在下可以被激活而發(fā)生催化作用，因此，研究者們構(gòu)建了一系列基于DNA酶的光學(xué)生物傳感器用于金屬離子的檢測(cè)。DNA酶有望用于實(shí)時(shí)或者多種金屬離子的同時(shí)檢測(cè)。

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