呂沈聰，趙穎穎，鐘衛(wèi)鴻

（浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州310032）

隨著多種細(xì)菌基因組測序工作的完成，獲得了大量的分子遺傳學(xué)信息。然而對分子遺傳結(jié)構(gòu)以及其中編碼基因的了解卻很有限?；蛲蛔兲峁┝艘环N了解單個基因功能的方法。基因的修飾以及修飾后細(xì)菌表型的研究對于功能基因組學(xué)的發(fā)展尤為重要。

20世紀(jì)80年代以來，生物學(xué)家發(fā)展了一種新型分子生物學(xué)技術(shù)——基因敲除。至今已涌現(xiàn)出多種不同的基因敲除技術(shù)［1－3］，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)、食品發(fā)酵工程等多個領(lǐng)域，展現(xiàn)出極大的發(fā)展空間。

大腸桿菌作為分子生物學(xué)的重要研究對象，是生產(chǎn)重組蛋白、氨基酸、有機(jī)酸等昂貴物質(zhì)的主要微生物。通過修飾大腸桿菌的基因組，改變其代謝途徑，以發(fā)酵生產(chǎn)有用物質(zhì)，已成為國內(nèi)外研究的熱點。作者在此簡要介紹了近幾年發(fā)展的幾種不同的Red同源重組技術(shù)及其在大腸桿菌基因敲除中的應(yīng)用。

1 Red同源重組作用機(jī)理

長的同源臂，往往長達(dá)幾百個堿基，而且同源重組效率低，往往不能得到所需的重組子。

1998年，Murphy［4］首次報道了利用λ噬菌體Red同源重組系統(tǒng)在大腸桿菌中進(jìn)行基因修飾的方法，將λ噬菌體的重組功能基因exo、bet、gam克隆到質(zhì)粒pTP223上，用于野生型大腸桿菌宿主的基因替換。Red同源重組又稱ET重組［5］，它不依賴宿主本身的重組系統(tǒng)，編碼Exo、Beta、Gam 3種蛋白質(zhì)。Exo蛋白是λ核酸外切酶，可以結(jié)合在雙鏈DNA的末端，從5′端向3′端降解 DNA 單鏈，產(chǎn)生3′突出末端［6］。bet基因編碼的Beta蛋白可以介導(dǎo)互補(bǔ)鏈之間的退火［7－10］。gam 基因編碼一個分子量為16 000Da的多肽，該多肽可與宿主RecBCD核酸外切酶結(jié)合，抑制核酸外切酶活性，防止外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后被宿主降解［11，12］。這3種蛋白協(xié)同作用，促進(jìn)同源重組的發(fā)生。該方法以其較短的同源臂、較高的重組效率等特點廣泛應(yīng)用于大腸桿菌的基因敲除中。

大腸桿菌基因敲除的傳統(tǒng)方法是利用其自身的RecA同源重組系統(tǒng)編碼的RecA和RecBCD蛋白介導(dǎo)DNA的同源重組。但是以該系統(tǒng)為基礎(chǔ)的基因打靶存在較多的缺點：首先，由于RecBCD具有核酸外切酶活性，線性的打靶DNA將被降解，打靶基因必須整合于載體上才能進(jìn)行同源重組；其次，打靶片段需要較

2 幾種不同的Red同源重組技術(shù)

2．1 兩步同源重組法

2000年，Datsenko等［13］提出了兩步同源重組法在大腸桿菌K－12中進(jìn)行基因敲除的策略。該方法以pKD46［14］作為同源重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒為低拷貝溫敏型質(zhì)粒，具有氨芐抗性，并將噬菌體的exo、bet、gam基因整合于阿拉伯糖啟動子控制下；質(zhì)粒pKD3和pKD4為打靶DNA的獲得提供模板，分別帶有氯霉素和卡那霉素抗性基因，并賦有FRT位點［15］（翻轉(zhuǎn)酶結(jié)合位點）；pCP20質(zhì)粒含有flippase基因［15］，表達(dá)的 FLP翻轉(zhuǎn)酶可以與FRT位點結(jié)合并消除抗性基因片段。

方法：第一步，將一段含有FRT位點的抗性基因置換入宿主染色體待敲除區(qū)域；第二步，將質(zhì)粒pCP20電轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，利用其表達(dá)的FLP翻轉(zhuǎn)酶將抗性基因敲除。

將pKD46轉(zhuǎn)化入宿主菌中，使其能夠表達(dá)λRed重組酶。以pKD3或pKD4為模板，PCR合成一段兩端與目的基因同源、中間含有抗性基因的雙鏈打靶DNA［16］。將該片段電轉(zhuǎn)化［17］入宿主細(xì)胞。L－阿拉伯糖誘導(dǎo)重組酶的表達(dá)，在重組蛋白的作用下，打靶DNA和細(xì)菌染色體基因的同源處發(fā)生交換，將抗性基因置換入宿主染色體，使其獲得相應(yīng)抗性。復(fù)蘇后抗性平板篩選得到突變子。將質(zhì)粒pCP20電轉(zhuǎn)化入宿主，利用其表達(dá)的FLP翻轉(zhuǎn)酶將染色體上的抗性基因敲除［14］，得到重組框架正確的突變株，如圖1所示。

圖1 兩步法基因敲除步驟Fig．1 Procedure of two－steps gene knockout method

以敲除大腸桿菌 K－12的lac操縱子為例［13］，敲除前后基因的序列結(jié)構(gòu)如圖2所示。

分別以pKD3和pKD4為模板，PCR得到打靶DNA，將打靶片段電轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，在重組酶的作用下完成同源重組。抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子用各自位點特異性引物驗證，證明得到的轉(zhuǎn)化子獲得了預(yù)期大小的重組結(jié)構(gòu)。測序結(jié)果表明lacZYA片段已經(jīng)被準(zhǔn)確敲除，留下完整的lacI片段。

圖2 分別用pKD3和pKD4敲除大腸桿菌K－12 lac操縱子Fig．2 Gene knockout of K－12 lac operon using pKD3and pKD4，respectively

應(yīng)用該敲除系統(tǒng)，美國普渡大學(xué)在大腸桿菌中成功敲除了40多個基因［13］。該方法所需要的打靶同源臂短，只需36～50bp，因此可以直接設(shè)計在引物上，而不需要DNA酶切和連接等程序，大大加快了實驗進(jìn)程。

閥1處產(chǎn)生觸發(fā)指令時實際換相線電壓已經(jīng)到達(dá)過零點，兩極電壓為正，閥1立刻導(dǎo)通，ca開始換相。同理，閥4處產(chǎn)生觸發(fā)指令時，為負(fù)，陰極電壓小于陽極電壓，立即導(dǎo)通，與上半橋一致。因此，當(dāng)0<σca>σca

兩步同源重組法操作簡單、實驗周期短、打靶精確度高，是目前大腸桿菌基因敲除領(lǐng)域應(yīng)用最為常見的方法。但該方法需要將外源DNA電轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，因此對DNA片段的濃度以及感受態(tài)的效率要求較高。然而某些菌株對外源DNA的吸收效率不高，進(jìn)入細(xì)胞的DNA量往往不足以進(jìn)行同源重組。同時，電轉(zhuǎn)化會導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡，只有很少部分宿主細(xì)胞能存活［18］。導(dǎo)致兩步同源重組法在這些菌株中未能實現(xiàn)成功敲除。

2．2 雙質(zhì)?；蚯贸?/h3>

雙質(zhì)粒基因敲除法包含一個輔助質(zhì)粒和一個供體質(zhì)粒。供體質(zhì)粒為打靶DNA提供來源，輔助質(zhì)粒含有重組酶和歸巢內(nèi)切酶基因。將兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，在誘導(dǎo)劑的作用下，歸巢內(nèi)切酶切割供體質(zhì)粒產(chǎn)生打靶DNA，重組酶促進(jìn)同源基因序列完成重組。

2．2．1 Gene gorging法

Gene gorging 法由 Herring 等［18］在 2003年報道，供體質(zhì)粒為高拷貝質(zhì)粒，常用的構(gòu)建骨架為pUC19、pACYC184、pDHA30、pCR－BluntⅡ－Topo。通過酶切方法將打靶序列以及歸巢內(nèi)切酶酶切位點（I－Sce I歸巢內(nèi)切酶識別的長18bp的特異序列）克隆于質(zhì)粒上。I－Sce I識別位點位于打靶序列兩側(cè)。輔助質(zhì)粒pACBSR上整合了表達(dá)Red重組酶和I－Sce I內(nèi)切酶的基因。在阿拉伯糖誘導(dǎo)下，表達(dá)的I－Sce I內(nèi)切酶特異性切割供體質(zhì)粒，產(chǎn)生打靶DNA。同時，Red重組酶則促進(jìn)打靶DNA與宿主染色體同源序列之間的重組，實現(xiàn)基因敲除。

Gene gorging法不同于兩步同源重組法，其打靶片段不需要外源轉(zhuǎn)化，而是在宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。質(zhì)粒在宿主內(nèi)大量復(fù)制，通過歸巢內(nèi)切酶的切割，導(dǎo)致每個細(xì)胞都產(chǎn)生打靶DNA，數(shù)量大大增加，提高了可能發(fā)生同源重組的細(xì)胞基數(shù)。據(jù)報道，在不使用任何篩選標(biāo)記的條件下，該方法篩選到突變株的概率達(dá)到1%～15%［18］。

某些大腸桿菌病原菌對于外源DNA的吸收效率低，運(yùn)用兩步同源重組法很難得到重組子。Gene gorging法不依賴于外源DNA的轉(zhuǎn)化，適合于在這些菌株中進(jìn)行基因敲除的嘗試。

Gene doctoring法包含供體質(zhì)粒pDOC以及輔助質(zhì)粒pACBSCE，原理與Gene gorging法類似，但在其基礎(chǔ)上增加了篩選條件，提高了篩選率。

供體質(zhì)粒pDOC來源于pEX100T［19］，整合了打靶基因的左右同源臂以及卡那霉素抗性基因，同源臂兩側(cè)為歸巢內(nèi)切酶酶切位點，此外還攜帶sacB基因［19］。輔助質(zhì)粒pACBSCE含有受阿拉伯糖調(diào)控的λ－Red重組酶基因和I－Sce I內(nèi)切酶基因。在L－阿拉伯糖的誘導(dǎo)下，兩種酶在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。I－Sce I內(nèi)切酶切割pDOC產(chǎn)生線性DNA打靶片段，同時也切割pACBSCE，使該質(zhì)粒逐漸消失，防止因λ－Red重組酶的過量表達(dá)導(dǎo)致染色體二次修飾［20－22］。在重組酶的作用下，線性打靶DNA和染色體的同源區(qū)發(fā)生交換，將卡那霉素抗性基因置換到宿主基因組上。菌液涂布于含有卡那霉素和蔗糖的LB瓊脂培養(yǎng)基上生長，篩選重組子。sacB基因的存在，使得含有供體質(zhì)粒的菌株無法在含有蔗糖的培養(yǎng)基上存活，因為sacB基因表達(dá)的酶會水解蔗糖生成高分子果糖聚合物毒害宿主細(xì)胞。因此只有攜帶抗性基因、并且不含質(zhì)粒pDOC的重組子才能在該培養(yǎng)基上生長，避免了假陽性轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)生。FLP翻轉(zhuǎn)酶敲除篩選得到重組子的抗性片段，如圖3所示。

圖3 Gene doctoring實驗流程Fig．3 Procedure of gene doctoring experiment

Lee等將pDOC－C和pACBSCE分別電轉(zhuǎn)化入不同E．coli 菌 株 K－12MG1655［23］、EHEC O157：H7 Sakai和 UPEC CFT073［24］中，應(yīng)用 Gene doctoring法對基因Rsd和Yocl進(jìn)行敲除（表1）。

表1 Gene doctoring在不同E．coli菌株中重組效率的比較Tab．1 Comparison of recombination efficiency of different E．coli strains with gene doctoring method

在含有卡那霉素和蔗糖的培養(yǎng)基上長出大量轉(zhuǎn)化子。PCR驗證發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)的克隆擁有正確的重組框架，并且超過90%的克隆對氨芐青霉素和氯霉素敏感，表明pDOC質(zhì)粒和pACBSCE質(zhì)粒已經(jīng)在細(xì)胞中消除。其中一個克隆經(jīng)PCR驗證，發(fā)現(xiàn)其待敲除部分基因框架與野生型的一樣，估計是卡那霉素基因插入到了該菌株染色體的其它部位。應(yīng)用Gene doctoring法在這些菌株中進(jìn)行敲除實驗，可以得到150個以上遺傳重組框架正確的突變子。

Lee等［19］比較了應(yīng)用pACBSCE與 Gene gorging法中的pACBSR分別進(jìn)行基因敲除的同源重組效率（表2）。

表2 應(yīng)用質(zhì)粒pACBSCE與質(zhì)粒pACBSR同源重組效率的比較Tab．2 Comparison of recombination efficiency using recombineering plasmids pACBSCE and pACBSR

應(yīng)用pACBSR作為重組質(zhì)粒能夠得到更多具備卡那霉素抗性、對蔗糖不敏感的重組子，其中丟失pDOC質(zhì)粒的克隆數(shù)跟應(yīng)用pACBSCE質(zhì)粒所得到的克隆數(shù)持平，但是其中大部分克隆仍含有pACBSR，只有很小部分消除了該重組質(zhì)粒。這就導(dǎo)致宿主細(xì)胞會過多地暴露于重組蛋白的作用下而發(fā)生二次重組，需要 另 外 將 其 從 宿 主 中 消 除［10，25，26］。 因 此 選 用pACBSCE質(zhì)粒更合適。

Gene doctoring法已經(jīng)成功應(yīng)用于各類大腸桿菌的基因敲除，包括一些運(yùn)用兩步同源重組法很難敲除的致病菌。該方法不僅繼承了Gene gorging法高打靶效率的優(yōu)點，并且增加了篩選標(biāo)記，在完成基因敲除的同時消除了同源重組輔助質(zhì)粒，提升了篩選效率。

2．3 單質(zhì)粒敲除法

單質(zhì)粒敲除法由Yu等［27］于2008年首次報道。該方法的特點在于只需單個質(zhì)粒即可完成宿主基因組的修飾，并且在染色體上不留殘余序列，重組效率高。

質(zhì)粒pREDI［27］（圖4）攜帶有2個獨立的啟動子：一個為阿拉伯糖啟動子，可誘導(dǎo)λ－Red重組蛋白表達(dá)，介導(dǎo)帶標(biāo)記的線性DNA打靶片段與目的基因區(qū)域的置換；另一個為鼠李糖啟動子，誘導(dǎo)I－Sce I歸巢內(nèi)切酶的表達(dá)，切割基因組，促進(jìn)雙鏈斷裂實現(xiàn)分子內(nèi)重組。剔除篩選標(biāo)記后，完成基因組的修飾。

圖4 質(zhì)粒pREDI圖譜Fig．4 The map of plasmid pREDI

圖5為應(yīng)用質(zhì)粒pREDI快速無痕敲除策略示意圖。為了敲除大腸桿菌基因組A區(qū)與C區(qū)之間的基因片段，通過PCR克隆出包含正篩選標(biāo)記（CmR）、負(fù)篩選標(biāo)記（sacB）、1個歸巢內(nèi)切酶酶切位點和3段同源區(qū)（A－C）的線性DNA打靶片段。將線性DNA打靶片段電轉(zhuǎn)化入含有質(zhì)粒pREDI的大腸桿菌中，涂布于含有阿拉伯糖的培養(yǎng)基上生長。在pREDI表達(dá)的重組酶作用下，打靶片段與目的基因發(fā)生置換。將菌株從含有10mmol·L－1阿拉伯糖的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到含有10mmol·L－1鼠李糖的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)I－Sce I歸巢內(nèi)切酶的表達(dá)。歸巢內(nèi)切酶切割染色體上的I－SceI酶切位點，形成 DSB（雙鏈斷裂模型）［28－30］。DSB介導(dǎo)兩個同源區(qū)（boxC）之間的重組，去除外源整合片段，達(dá)到無痕修飾的目的。

圖5 應(yīng)用質(zhì)粒pREDI快速無痕敲除策略Fig．5 Description of rapid markless gene knockout with plasmid pREDI

I－Sce I歸巢內(nèi)切酶作用于細(xì)胞染色體上的酶切位點使DNA雙鏈斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此只有去除了整合位點、修復(fù)了缺口、形成了正確突變結(jié)構(gòu)的細(xì)胞才能存活。據(jù)報道，該方法的敲除成功率達(dá)到70%～100%［27］。

單質(zhì)粒敲除法只需單個質(zhì)粒pREDI就可成功進(jìn)行基因組上的突變，完成一次敲除只需要2d，而且突變菌株染色體上不留任何痕跡。相比于之前的方法有了更大的進(jìn)步，適用于一系列的基因修飾工作，例如在大腸桿菌或其它革蘭氏陰性菌株中進(jìn)行基因的點突變、基因定點插入等。

3 結(jié)語

兩步同源重組法所需同源臂短，不需要構(gòu)建于載體上，非常適合應(yīng)用于常見大腸桿菌的基因敲除，例如K系列菌株，對外源DNA的吸收效率較高，打靶成功率大。Gene gorging法不含篩選標(biāo)記，因此在某些情況下篩選工作較大、實驗周期長。基于Gene gorging的Gene doctoring法以高打靶率、高篩選率等優(yōu)點逐漸應(yīng)用于各類致病菌的基因敲除，例如EHEC O157：H7Sakai和UPEC CFT073等，它們對外DNA吸收效率低，運(yùn)用兩步同源重組法很難成功。單質(zhì)粒敲除法實驗周期短、打靶效率較高，也逐漸應(yīng)用于各類大腸桿菌的基因修飾工作中。

作為與人類最為密切的微生物，大腸桿菌的代謝工程研究意義重大。通過修飾其基因組，使其獲得新的優(yōu)良性狀和生產(chǎn)能力是目前國內(nèi)外研究的熱點。Red同源重組技術(shù)的誕生為大腸桿菌染色體的修飾提供了強(qiáng)有力的工具，是基因工程領(lǐng)域的一場革命。而且該技術(shù)在其它細(xì)菌中成功進(jìn)行基因敲除的報道也越來越多。作為一項高效基因打靶技術(shù)，Red同源重組技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)絹碓綇V，有望為基因功能的改良及后基因組時代功能研究作出巨大貢獻(xiàn)。

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