涂雨辰，田 云，盧向陽(yáng)

（1．湖南省農(nóng)業(yè)生物工程研究所，湖南 長(zhǎng)沙410128；2．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128）

1 GWAS的發(fā)展背景

重要的農(nóng)藝性狀如產(chǎn)量、作物品質(zhì)以及植物抗病性是由多個(gè)基因控制的，均受連續(xù)變化且脆弱的環(huán)境影響。與單基因控制的性狀相比，其遺傳基礎(chǔ)更為復(fù)雜。Visscher等［1］指出，眾多科學(xué)和生物的發(fā)現(xiàn)已通過全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）所驗(yàn)證。GWAS是經(jīng)典的定量遺傳理論的拓展，對(duì)基因的研究具有重大意義。作為一個(gè)整體，定量特征是由許多具有同等作用的微效基因互相影響，通過建立遺傳模型和估計(jì)遺傳方差，選擇統(tǒng)計(jì)參數(shù)來進(jìn)行研究。許多經(jīng)典的定量遺傳模型都在育種實(shí)踐中發(fā)揮著重要作用，比如籽粒的淀粉［2］和維生素A原含量［3］、小麥的籽粒大小和研磨品質(zhì)［4］、擬南芥（Arabidopsis thaliana）的開花期［5］和抗病性［6］等。然而，在“Micro－effect gene”理論中，具體影響數(shù)量性狀的基因尚未發(fā)現(xiàn)，分子生物學(xué)機(jī)制的定量特征變化也未能得出確切結(jié)論。近年隨著生物技術(shù)的發(fā)展，尤其是分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展，人們對(duì)量化特征的認(rèn)識(shí)從基因水平發(fā)展到數(shù)量性狀分析水平，充分說明理解遺傳機(jī)制的定量特征已經(jīng)上升到分子水平的高度。

此外，植物的數(shù)量性狀往往受到等位基因多樣性的影響，而傳統(tǒng)研究?jī)H能得到有限的基因組相關(guān)解析。GWAS克服傳統(tǒng)基因映射方法的一些局限性，通過提供更高的分辨率，在基因水平上利用樣本的數(shù)量關(guān)聯(lián)到表型變化的差異。由于高密度單核苷酸（SNP）多態(tài)性的出現(xiàn)，進(jìn)行全基因組掃描時(shí)，能識(shí)別很小范圍的與數(shù)量性狀變異顯著相關(guān)的單元型域。這些方法的出現(xiàn)使得研究性狀的可能性不斷增大。目前，GWAS已經(jīng)確定了許多與性狀相關(guān)的重要位點(diǎn)，為生產(chǎn)實(shí)踐提供理論指導(dǎo)。

2 GWAS的研究原理及研究策略

與日益普及的基因組多態(tài)性數(shù)據(jù)相比，GWAS正成為研究遺傳學(xué)定量特征的默認(rèn)方法。通過GWAS，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)以百計(jì)的遺傳變異與人類疾病相關(guān)的復(fù)雜的特征，徹底改變了人類基因圖譜，并且現(xiàn)在也廣泛應(yīng)用于植物研究中。

GWAS的研究原理是：在基因水平上通過分子標(biāo)記的手段，對(duì)整個(gè)基因組內(nèi)的SNP進(jìn)行綜合分析與分型，再將不同表現(xiàn)的性狀變異統(tǒng)計(jì)出來，提出假設(shè)，并且驗(yàn)證其與期望性狀間的關(guān)聯(lián)性。

GWAS的研究策略類似于傳統(tǒng)的候選基因法。在設(shè)計(jì)初始GWAS實(shí)驗(yàn)時(shí)，一般分成兩個(gè)階段：首先對(duì)整個(gè)基因組SNP基因分型芯片和SNP多態(tài)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通常能夠篩選少量陽(yáng)性SNPs，然后在更多樣本中對(duì)這些陽(yáng)性SNPs進(jìn)行基因分型，最后整合兩個(gè)階段的結(jié)果進(jìn)行分析。GWAS兩階段研究策略減少了工作量和成本，通過重復(fù)實(shí)驗(yàn)也減小了誤測(cè)率；但是在第一階段，所有可能與疾病相關(guān)聯(lián)的SNP多態(tài)性的樣本量不足。為了尋找更多的易感基因位點(diǎn)，目前常用的方法是擴(kuò)大GWAS的樣本量，即在同一時(shí)間適當(dāng)放寬第一階段的選擇標(biāo)準(zhǔn)并擴(kuò)大驗(yàn)證SNP多態(tài)性的范圍。

3 GWAS在植物中的應(yīng)用

3．1 在玉米育種方面的應(yīng)用

在過去的20年中，伴隨著基因組學(xué)以及分子標(biāo)記技術(shù)的飛速發(fā)展，作物遺傳育種方面的研究得到有效且深入的開展。在玉米研究方面，2011年《Nature Genetics》上發(fā)表了1篇關(guān)于GWAS研究玉米相關(guān)性狀的文章。文中通過GWAS得到一個(gè)玉米嵌套的關(guān)聯(lián)映射面板，確定了玉米重要葉片結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)架構(gòu)特征和一些關(guān)鍵基因，并證明了葉片性狀、基因結(jié)構(gòu)是受基因多效性及環(huán)境相互作用的影響。GWAS結(jié)果表明，突變體基因的變化導(dǎo)致更多的葉片向上生長(zhǎng)。玉米的多樣性對(duì)GWAS來說是個(gè)挑戰(zhàn)，然而，在玉米Hap Map中160萬(wàn)個(gè)SNPs位點(diǎn)被鑒定、嵌套關(guān)聯(lián)繪圖（NAM）也有所發(fā)展之后，在玉米研究中有效開展GWAS不再是難題。玉米NAM嵌板是基于一個(gè)參考線，由25條不同的交叉線組成，然后產(chǎn)生5000個(gè)重組自交系（RILs）。作者運(yùn)用這種新型的玉米NAM設(shè)計(jì)并分析向上葉片角度的結(jié)構(gòu)、葉片長(zhǎng)度以及寬度，再運(yùn)用Joint stepwise regression鑒定出30～36個(gè)QTLs，解釋了74．8%～80．3%的表型變異，以及大于83%的遺傳方差。為了進(jìn)一步剖析這些QTLs，通過輸入160萬(wàn)個(gè) Hap Map SNPs位點(diǎn)進(jìn)行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)27個(gè)NAM母系映射到RILs上。在160萬(wàn)個(gè)測(cè)試的SNPs中，作者探測(cè)到與葉片角度、長(zhǎng)度、寬度相關(guān)的SNP位點(diǎn)分別是203、287、295。在其它復(fù)雜的玉米性狀里也能觀察到類似的基因結(jié)構(gòu)［7，8］，與動(dòng)物一樣［9］，對(duì)自花授粉植物有更大的 影響［10－12］。這些結(jié)果表明復(fù)雜性狀的基因結(jié)構(gòu)在異形雜交和自交的物種中的進(jìn)化程度相同。

3．2 在大麥及大豆分子標(biāo)記研究中的應(yīng)用

Lorenz等［13］研究發(fā)現(xiàn)，大麥中單獨(dú)關(guān)聯(lián)到早熟性狀的位點(diǎn)對(duì)應(yīng)著33個(gè)染色體區(qū)域，并確定了15個(gè)與其它性狀相關(guān)的重要標(biāo)記和7個(gè)區(qū)域［14］。對(duì)于每一個(gè)性狀的分析，都需要經(jīng)過包括SSR、SNP和DArT在內(nèi)的760個(gè)標(biāo)記來確定。研究發(fā)現(xiàn)，共有130個(gè)顯著特征關(guān)聯(lián)標(biāo)記以及8～22個(gè)重要位點(diǎn)，這也代表了62個(gè)標(biāo)記存在于除染色體5d之外的所有染色體上。而觀察圖譜的位置，最明顯的候選基因（Ppd－1，Vrn－1，Vrn－2，Vrn－3，Vrn－4，Rht－1）也表現(xiàn)出顯著的相關(guān)性［15－18］。而在大豆中，關(guān)聯(lián)到重要性狀的重要位點(diǎn)分別為I、T、W1、R、O［19，20］，這些位點(diǎn)的確定對(duì)植物生長(zhǎng)和作物生產(chǎn)實(shí)踐都起到重大的作用。

3．3 在挖掘水稻重要遺傳基因位點(diǎn)方面的應(yīng)用

世界上約一半人口以大米為主食，但其產(chǎn)量常常受到大量病原微生物或昆蟲的嚴(yán)重威脅［21－23］。為了有效識(shí)別遺傳多樣性的種植水稻種質(zhì)資源，挖掘水稻高品質(zhì)性狀相關(guān)的基因、培養(yǎng)遺傳改良品種的水稻，對(duì)水稻實(shí)踐生產(chǎn)意義重大。

近年來開展的全基因組測(cè)序分析可通過基因組之間的差異挖掘出與水稻重要性狀相關(guān)的位點(diǎn)。研究者分別對(duì)517類不同的水稻種質(zhì)測(cè)序，鑒定出360萬(wàn)個(gè)SNP序列，構(gòu)成一個(gè)水稻基因高密度單體型圖。通過GWAS研究，解釋了水稻品種中36%的表型方差，將其分為以下5類農(nóng)藝性狀：形態(tài)特征（分蘗數(shù)、葉角度）、收益率（谷粒寬度、粒長(zhǎng)、千粒重和小穗數(shù)）、糧食質(zhì)量（糊化溫度和直鏈淀粉含量）、著色（頂端顏色、果皮顏色和外殼顏色）和生理特性（抽穗期、抗旱能力和種子破碎的程度）。通過GWAS研究，確定了稻秈亞種的14個(gè)農(nóng)藝性狀。研究者將高通量基因組測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于950份來自不同國(guó)家的水稻種質(zhì)材料中，通過基因分型鑒定基因的變異。該體系能高效、準(zhǔn)確地確定多個(gè)重要性狀的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，分別鑒定出1個(gè)控制花期的位點(diǎn)和10個(gè)與糧食主產(chǎn)性狀相關(guān)的32個(gè)新位點(diǎn)［24］。

3．4 在擬南芥性狀研究中的應(yīng)用

研究復(fù)雜性狀的遺傳基礎(chǔ)，如開花時(shí)間、伸長(zhǎng)速度和產(chǎn)量，已經(jīng)成為改善作物和了解植物適應(yīng)性的重點(diǎn)。擬南芥分布廣泛，一直是研究植物自然變異和適應(yīng)性的極具價(jià)值的模式植物。通過全基因組基因分析，Aranzana等確定了擬南芥基因中控制自然變異、開花時(shí)間和病原體抵抗的相關(guān)位點(diǎn)。通過分析擬南芥的107種表型，GWAS搜尋到250 000個(gè)SNP位點(diǎn)［25］。通過GWAS來識(shí)別潛在的反應(yīng)變異，其中最為明顯的反應(yīng)為控制下胚軸的伸長(zhǎng)。結(jié)果表明，這些性狀的變異受基因座的影響，符合YUCCA5、YUCCA9和RGA1 3組基因的控制模式。YUCCA5和YUCCA9都參與生長(zhǎng)素生物合成，而RGA1是DELLA家族的成員。下胚軸表型包括在這項(xiàng)研究中，它們是高度的高R：FR條件（模擬太陽(yáng)）、高度的低R：FR條件（模擬陰影）和2個(gè)不同指數(shù)響應(yīng)低R：FR條件。GWAS結(jié)果表明，這些性狀的變異由許多基因座的低到中度影響控制。

不同作物重要性狀的相關(guān)位點(diǎn)見表1。

表1不同作物重要性狀的相關(guān)位點(diǎn)Tab．1 The related loci of important traits for different species

4 結(jié)語(yǔ)

GWAS為大量的基因組測(cè)序提供了一個(gè)很好的平臺(tái)，由于其技術(shù)方法能擴(kuò)展到在生態(tài)環(huán)境中且能適應(yīng)遺傳變異的結(jié)構(gòu)化背景，與人類疾病GWAS相比，在植物研究中獲得了更大的成功［30］。為了能更高效地運(yùn)用GWAS技術(shù)，首先，在選擇基因樣本時(shí)，應(yīng)盡量選擇優(yōu)質(zhì)品種的優(yōu)良基因，以提高分析的精確度與有效性；其次，SNP位點(diǎn)對(duì)作物性狀的影響基于影響基因的表達(dá)程度，所以應(yīng)該提高對(duì)基因編碼區(qū)以及相關(guān)調(diào)控方式的認(rèn)識(shí)，更確切地了解植物復(fù)雜性狀的成因；最后，GWAS能夠一次性對(duì)重要性狀進(jìn)行輪廓性概覽，適用于復(fù)雜性狀的研究。在全基因組層面上，開展多中心、大樣本、反復(fù)驗(yàn)證的基因與性狀的關(guān)聯(lián)研究，是全面揭示疾病發(fā)生、控制其發(fā)展的重要手段。

由于植物性狀與基因組之間的關(guān)系受多種因素的作用［31］，GWAS也面臨著一些問題，如結(jié)果不能完全解釋某些復(fù)雜性狀等。但隨著功能標(biāo)記開發(fā)、反向遺傳學(xué)研究及生理學(xué)等學(xué)科的綜合推進(jìn)，作為一種綜合性的分析方法，GWAS必將迎來更為廣闊的發(fā)展空間。在提高自動(dòng)化和高效率的同時(shí)，通過降低成本、挖掘與植物重要經(jīng)濟(jì)性狀或生理性狀相關(guān)的位點(diǎn)，GWAS必將在植物遺傳育種中發(fā)揮更大的作用。

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