郝英利，張燎原，孫建安，魏東芝，周文瑜，沈亞領，朱家文

（1．華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室 魯華生物技術研究所，上海200237；2．華東理工大學化工分離研究所，上海200237）

隨著儲量有限的傳統(tǒng)能源的日益匱乏，新興的可再生生物能源引起人們越來越多的重視。2，3－丁二醇（2，3－Butanediol，BD）具 有 高 燃 燒 值 （27 200kJ·kg－1）和低冰點，是一種優(yōu)良的低溫環(huán)境下的燃料添加劑［1，2］。2，3－丁二醇用途十分廣泛：可以制備多種衍生物，脫水可生成甲乙酮，是廣泛應用于電子元件清洗、涂料、染料、印刷油墨、煉油等多個領域的工業(yè)溶劑［3－5］；脫水轉化生成1，3－丁二烯，是合成橡膠的重要前體［6，7］；脫氫轉化生成3－羥基－2－丁酮（乙偶姻，AC），是具有多種用途的天然食用香料［8］；和乙酸可催化合成2，3－丁二醇二乙酸酯，廣泛應用于奶制品行業(yè)中，用于改善風味［9，10］；通過 Diels－Alder反應可轉化為苯乙烯［11］；合成聚氨酯泡沫材料，廣泛應用于洗滌劑、藥品、化妝品等多個領域［12］；是一種優(yōu)良的白酒風味添加劑，適當添加可大大提高酒類的口感［1］。

由于2，3－丁二醇具有2個手性碳原子、3種同分異構體，生物法制備2，3－丁二醇極具優(yōu)勢，因而得到了廣泛的研究，高產2，3－丁二醇的報道［13］也比較多。然而，多數研究利用的是昂貴的實驗級有機氮源［14］，價格較高、不利于工業(yè)化生產。

作者在此利用基因改造過的粘質沙雷氏菌G1，以玉米漿干粉（CSLP）和磷酸氫二銨［（NH4）2HPO4］為氮源發(fā)酵生產2，3－丁二醇，降低了培養(yǎng)基的成本，為工業(yè)化生產奠定了基礎。

1 實驗

1．1 菌種和培養(yǎng)基

出發(fā)菌株：粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）G1，實驗室保藏，保存于－80℃甘油管中。

斜面培養(yǎng)基（g·L－1）：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨5，瓊脂20，以NaOH調pH 值7．2。

種子培養(yǎng)基（g·L－1）：葡萄糖10，酵母粉1，蛋白胨2，（NH4）2SO46，KH2PO410，NaCl 0．5，MgSO40．5，以 NaOH 調pH 值7．2，115℃滅菌20min。

發(fā)酵基礎培養(yǎng)基（g·L－1）：蔗糖90，酵母粉30，（NH4）2HPO43，NaAc 4，檸檬酸鈉14，MgSO40．5，FeSO40．02，MnSO40．01。

1．2 培養(yǎng)方法

1．2．1 種子培養(yǎng)

在250mL搖瓶中裝入30mL種子培養(yǎng)基，接一甘油管種子至種子培養(yǎng)基中，于30℃、200r·min－1下搖床培養(yǎng)12h。

1．2．2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

按5%（體積比）的接種量轉接種子至裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，于30℃、200r·min－1下搖床培養(yǎng)。

1．2．3 分批補料發(fā)酵培養(yǎng)

取100mL種子液接種于3．7L比歐發(fā)酵罐（KL F2000），起始裝液量為2L，轉速為300r·min－1，通氣量為0．8VVm，初始糖濃度為90g·L－1，當殘?zhí)牵≧G）濃度低于5g·L－1時，用蠕動泵補料補入800g·L－1蔗糖溶液，控制蔗糖濃度5～10g·L－1。

1．3 實驗設計

工業(yè)氮源的初篩：分別以價格低廉的工業(yè)氮源復合氨基酸、黃豆餅粉、可溶性氮源、玉米漿干粉替代酵母粉配制發(fā)酵培養(yǎng)基，4種氮源的濃度均為30g·L－1。

培養(yǎng)基的優(yōu)化：配制不同濃度玉米漿干粉發(fā)酵培養(yǎng)基進行單因素實驗；應用Minitab軟件系統(tǒng)設計Plackett－Burman（PB）實 驗 優(yōu) 化 玉 米 漿 干 粉、（NH4）2HPO4及無機鹽的配比；根據PB實驗結果確定爬坡步長，設計爬坡實驗；根據爬坡實驗結果，應用Minitab軟件系統(tǒng)，進行中心組合設計和響應面設計，進行2因子5水平的組合實驗。

發(fā)酵罐驗證：采用恒底物濃度策略［14］進行實驗。

1．4 分析方法

菌體濃度測定：采用UV22008H 型分光光度計（Unic）在波長600nm處測定OD600。

發(fā)酵液中殘?zhí)牵?4，15］測定：將樣品離心，取上清液用2mol·L－1H2SO4溶液水解，再用4mol·L－1NaOH溶液中和，用葡萄糖液體試劑盒（上海捷門生物技術公司）測定葡萄糖的濃度，再換算成殘?zhí)菨舛取?/p>

產物［14，15］測定：用 Aglient GC9860型氣相色譜儀測定AC和BD的濃度。色譜柱采用毛細管柱DB－5，FID氫火焰檢測器，氮氣作為載氣，流速為1mL·min－1，柱溫為50℃保留115min、然后25℃·min－1程序升溫到180℃保留10min，進樣口溫度為215℃，檢測器溫度為245℃。發(fā)酵液離心后用乙酸乙酯萃取，再用氣相色譜儀測定濃度，最后根據標準曲線計算產物濃度。

2 結果與討論

2．1 工業(yè)氮源的篩選（圖1）

圖1 不同工業(yè)氮源對產物的影響Fig．1 Effect of different industrial nitrogen sources on product

由圖1可知，復合氨基酸作為氮源時，生物量較低；黃豆餅粉和可溶性氮源作為氮源時，產物濃度較低，雜質較多；玉米漿干粉作為氮源時，不僅能夠滿足菌體的生長，而且利于2，3－丁二醇的積累。因此，后續(xù)實驗選擇玉米漿干粉作為培養(yǎng)基氮源。

2．2 單因素實驗（圖2）

圖2 玉米漿干粉濃度對產物的影響Fig．2 Effect of CSLP concentration on product

由圖2可知，玉米漿干粉濃度在20g·L－1左右時已經可以滿足菌體生長、產物合成的需要。

2．3 Plackett－Burman實驗篩選培養(yǎng)基中顯著因素

應用Minitab軟件系統(tǒng)設計PB實驗篩選發(fā)酵培養(yǎng)基顯著因素，實驗因素與水平見表1，實驗設計與結果見表2。

表1 PB實驗因素與水平／g·L－1Tab．1The factors and levels of PB experiment／g·L－1

表2 PB實驗設計與結果Tab．2 The design and results of PB experiment

PB實驗數據經Minitab 15．0軟件分析得到擬合方程如下：

式中：Y 為2，3－丁二醇濃度，g·L－1。

PB 實 驗 的 R－Sq為 99．03%、R－Sq（adj．）為96．44%，說明模型對產物水平的變化有良好擬合度。其中玉米漿干粉、（NH4）2HPO4的P值分別為0．014與0．007，說明玉米漿干粉與（NH4）2HPO4對2，3－丁二醇濃度的影響最顯著。

2．4 爬坡實驗

爬坡實驗中玉米漿干粉與（NH4）2HPO4的濃度變化按照PB實驗結果逐步增加。步長（4．873，6．279）近似為（1，1．25），即玉米漿干粉濃度每增加1個單位（4g·L－1），（NH4）2HPO4增加1．25g·L－1，結果如圖3所示。

圖3 爬坡實驗結果Fig．3 Results of the steepest ascent experiment

由圖3可知，隨著玉米漿干粉濃度的增大，蔗糖的消耗速率逐漸加快，2，3－丁二醇的濃度不斷提高；當玉米漿干粉濃度大于20g·L－1、（NH4）2HPO4濃度大于7g·L－1時，菌體的生長和代謝逐漸受到抑制。這是因為，高濃度的（NH4）2HPO4會產生游離的氨，對細胞有毒性，造成了對生長和代謝的抑制。

2．5 中心組合和響應面實驗

玉米漿干粉（X1）和（NH4）2HPO4（X2）的中心點分別取20g·L－1和7g·L－1，其它培養(yǎng)基組分（g·L－1）如下：蔗糖90、NaAc 4、檸檬酸鈉14、MgSO40．5、FeSO40．02、MnSO40．01，進行中心組合實驗，其設計和結果見表3。

表3 中心組合實驗設計與結果Tab．3 The design and results of the central composition experiment

中心組合實驗數據分析經 Minitab 15．0軟件分析得到擬合方程如下：

Y＝42．7406＋0．9245 X1＋0．2210 X2－1．52 X21－1．0502 X＋0．0313 X1X2

式中：Y 為2，3－丁二醇濃度，g·L－1。

中心組合實驗的R－Sq為96．43%、R－Sq（adj．）為93．88%，表明模型可以解釋93．88%的發(fā)酵水平的變化。根據回歸方程，利用Minitab 15．0軟件繪制響應面立體圖，見圖4。

圖4 響應面立體圖Fig．4 The three－dimensional graph for the response surface

由圖4可以看出，兩個因素之間交互作用不顯著，最佳點落在實驗考察的區(qū)域內。為了進一步求證最佳點的值，對回歸方程求一階偏導，通過回歸方程計算得到最優(yōu)的培養(yǎng)基組分濃度為：玉米漿干粉20．32g·L－1、（NH4）2HPO47．21g·L－1，2，3－丁二醇濃度預測值為42．74g·L－1。由此確定的優(yōu)化培養(yǎng)基（g·L－1）為：蔗糖90，玉米漿干粉20．32，（NH4）2HPO47．21，NaAc 4，檸檬酸鈉14，MgSO40．5，FeSO40．02，MnSO40．01。

為驗證響應的最優(yōu)值的可信度，共進行了3批驗證實驗，18h時的2，3－丁二醇濃度分別為43．72g·L－1、42．45g·L－1和43．02g·L－1，平均值為43．06 g·L－1，與預測值42．74g·L－1基本吻合。

2．6 發(fā)酵罐驗證實驗

在3．7L發(fā)酵罐中采用上述優(yōu)化培養(yǎng)基進行驗證實驗，結果見圖5。

圖5 粘質沙雷氏菌G1的分批補料發(fā)酵結果Fig．5 The fed－batch fermentation result of Serratia marcescens G1

由圖5可以看出，AC濃度為8．35g·L－1、2，3－丁二醇濃度為128．28g·L－1，2，3－丁二醇的產率為2．67g·L－1·h－1、轉化率為0．48g·g－1蔗糖。表明以玉米漿干粉、（NH4）2HPO4為氮源，能夠大大降低2，3－丁二醇工業(yè)化生產中培養(yǎng)基原料的成本，提高了工業(yè)化的經濟可行性。

2．7 討論

為了提高工業(yè)化生產2，3－丁二醇的經濟可行性，可以采取多種方法，如傳統(tǒng)的篩選高產菌株、基因改造高產菌株［16］、設計優(yōu)化便宜有效的培養(yǎng)基等。本研究采用的粘質沙雷氏菌G1菌株為基因工程菌，具有副產物濃度低、發(fā)酵過程氣泡少、無紅色素等特點。副產物濃度低，從發(fā)酵原理上簡化了發(fā)酵控制難度；發(fā)酵過程氣泡少，從實際操作上降低了發(fā)酵控制的難度；菌體不產紅色素，有利于發(fā)酵液的后續(xù)處理。上述特點使得該菌株非常適于工業(yè)化生產。

在之前的基礎研究中［14］，實驗采用較為昂貴的實驗級有機氮源，不利于工業(yè)化生產，本研究從2，3－丁二醇工業(yè)化生產的角度出發(fā)，篩選了多種工業(yè)氮源，最終確定玉米漿干粉和（NH4）2HPO4為氮源。

玉米漿干粉是玉米深加工行業(yè)的主要副產品，來源豐富、價格便宜［17］，其中含有47%的粗蛋白，實驗表明玉米漿干粉能夠滿足菌體生產和轉化的需要，有利于積累較高的產物濃度。（NH4）2HPO4作為農用肥具有價格低、供應大、含氮量高等特點，可作為有機氮源的有力補充，滿足菌體的生長，且磷酸根能夠刺激2，3－丁二醇的合成［18］。

優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方除糖外，只有少量的玉米漿干粉和便宜的無機鹽，降低了培養(yǎng)基的成本，為2，3－丁二醇的規(guī)?；?、工業(yè)化生產奠定了堅實的基礎。

3 結論

篩選玉米漿干粉和（NH4）2HPO4作為粘質沙雷氏菌G1發(fā)酵產2，3－丁二醇的氮源，通過PB實驗、中心組合和響應面實驗確定最優(yōu)培養(yǎng)基組成（g·L－1）為：蔗糖90，玉米漿干粉20．32，（NH4）2HPO47．21，NaAc 4，檸檬酸鈉 14，MgSO40．5，FeSO40．02，MnSO40．01。搖瓶發(fā)酵和分批補料發(fā)酵結果表明以玉米漿干粉和（NH4）2HPO4作氮源，2，3－丁二醇濃度較高，培養(yǎng)基的成本大幅降低，為工業(yè)化生產奠定了基礎。

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