余榛榛，常明，劉睿杰，金青哲，劉元法，王興國(guó)

(食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 食品安全與營(yíng)養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

單核細(xì)胞增多性李斯特菌(L. monocytogenes，簡(jiǎn)稱Lm)是一種重要的食源性致病菌，兼性厭氧。溫度適應(yīng)性很強(qiáng)，-20℃時(shí)仍可部分存活，巴氏消毒也不能完全滅活。菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，能在物體表面形成生物膜對(duì)抗菌物質(zhì)有抵抗作用，抗逆性較強(qiáng)，包括耐酸，耐反復(fù)凍溶，耐干燥以及耐鹽［1］。Lm 在自然界中廣泛存在，易在野生動(dòng)物、家畜、鳥類、昆蟲、污水、土壤和植物中生長(zhǎng)，相關(guān)產(chǎn)品如牛、羊、家禽、乳制品、水果、蔬菜、熟肉制品、海產(chǎn)品中也常能檢測(cè)到該菌。

研究表明，磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)是Lm 的主要毒力因子［1］，在細(xì)胞代謝、信息傳遞和抗血小板功能等方面起著重要作用。國(guó)內(nèi)外已將其作為重要生理活性成分及醫(yī)藥原料，廣泛應(yīng)用于藥品、化妝品、食品加工等領(lǐng)域［2-4］。PLC 的作用位點(diǎn)為甘油磷脂C3 位酯鍵，水解生成甘油二酯(DAG)及磷脂酸化合物，如磷酸膽堿、磷酸乙醇胺、磷酸絲氨酸以及磷酸肌醇等(圖1)。由于PLC 水解磷脂生成的DAG 是油脂的正常組分，DAG 的變化不僅不會(huì)影響精煉油脂的品質(zhì)，而且可以提高精煉油得率，近年來日益得到油脂行業(yè)的關(guān)注，將其應(yīng)用于油脂酶法脫膠。

圖1 磷脂酶C 水解磷脂圖Fig.1 Phospholipase C hydrolyze phospholipids

PLC 酶法脫膠具有適用性廣，反應(yīng)條件溫和，生產(chǎn)中節(jié)省酸堿化學(xué)品的消耗，幾乎不產(chǎn)生皂腳和廢水，經(jīng)濟(jì)效益增長(zhǎng)明顯等一般酶法脫膠的共同優(yōu)點(diǎn)，但相較于其他的酶法脫膠，如磷脂酶A (Phospholipase A ，PLA)酶法脫膠，PLC 酶法脫膠不僅能大大縮短脫膠反應(yīng)時(shí)間，還能有效提高毛油得率，降低毛油損耗，通常每500 mg/L 磷就可以提高約1%的油產(chǎn)量［5］，該特點(diǎn)在糧食價(jià)格持續(xù)上漲的現(xiàn)今社會(huì)顯得尤為重要。本文通過克隆單增李斯特氏菌plcB 基因，重組表達(dá)PLC，并應(yīng)用該酶對(duì)不同的植物毛油進(jìn)行脫膠研究，具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

單核細(xì)胞增多性李斯特菌(L. monocytogenes)CICC No.21540，購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC);大腸桿菌(Escherichia coli)JM109、BL21(DE3)、表達(dá)載體pET-28a(+)均由本實(shí)驗(yàn)室保存;克隆載體pMD18-T simple，購(gòu)自大連寶生物(TaKaRa)公司。

1.1.2 主要試劑

T4 DNA 連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶NotⅠ、EcoRⅠ，均購(gòu)自NEB 公司;對(duì)硝基磷酸膽堿(p-nitrophehylphosphoryl-choline，簡(jiǎn)稱p-NPPC)、考馬斯亮藍(lán)R-250，購(gòu)自Sigma 公司;蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(低)、Ex Taq DNA 聚合酶、DNA Marker DL10000，均購(gòu)自大連寶生物(TaKaRa)公司;飽和酚、硫酸卡那霉素(Kana)、氨芐青霉素(Amp)、SanPrep 柱式質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒、SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒，San-Prep 柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、丙烯酰胺，N，N’-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)，購(gòu)自上海生工生物工程公司;大豆毛油，由中糧提供;菜籽毛油，由湖州新市油廠提供;米糠毛油，由鎮(zhèn)江丹陽油廠提供;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

腦心瓊脂培養(yǎng)基:心提取物5 g/L，腦提取物12.5 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖2 g/L，NaCl 5 g/L，Na2HPO42.5 g/L，瓊脂15 g/L，pH 7.4。

LB 液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母粉5 g/L，pH 7.4?？剐院Y選時(shí)加入氨芐青霉素或卡那霉素至終濃度為100 g/mL;LB 固體培養(yǎng)基，添加20 g/L 的瓊脂粉。

TB 液體培養(yǎng)基:蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，甘油4 mL/L，磷酸鹽緩沖液(K2HPO412.54 g、KH2PO42.31g)100 mL/L。

1.2 L. monocytogenes 基因組DNA 的提取及l(fā)mplcB 基因的克隆

L. monocytogenes 基因組的提取參照/氯仿-CTAB法［6］。

根據(jù)NCBI 上提供的L. monocytogenes 的plc 基因序列(YP 005964174.1)為模板，去掉信號(hào)肽后設(shè)計(jì)上下游引物:上游引物P1:5’-CGGAATTCATGTGTTGTGATGAATACTTACAAA-3＇(EcoRI);下游引物P2: 5 ’-ATGCGGCCGCTTATTCATTTGTTTTTTT-3＇(NotI)。PCR 反應(yīng)條件為:94℃，5 min;94℃，30 s，50℃，30 s，72℃，1 min，30 個(gè)循環(huán);72℃，10 min，4 ℃保溫。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)SanPrep 柱式PCR 產(chǎn)物純化試劑盒純化回收后，與pMD18-T simple 連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E. coil(JM109)，經(jīng)Amp-LB 培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)篩選陽性克隆，PCR 鑒定后測(cè)序，命名為pMD18-T-lm-plcB。

1.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶EcoR I 和Not I 對(duì)重組載體pMD18T-lm-plcB 和表達(dá)載體pET28a(+)進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒純化后利用T4 DNA 連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E. coli(JM109)，經(jīng)Kana-LB 培養(yǎng)基篩選，并對(duì)陽性菌落進(jìn)行PCR 和酶切鑒定。

1.4 重組磷脂酶C 的誘導(dǎo)表達(dá)

分別將表達(dá)質(zhì)粒pET28a-lm-plcB 和pET28a(+)轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌株E. coli BL21(DE3)，將獲得的陽性克隆E. coil BL21(DE3)/pET28a-lm-plcB 接種于Kana-LB 液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min 培養(yǎng)12 h作為種子液。隨后將種子液按5%接種量接種于Kana-TB 培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)進(jìn)行發(fā)酵。當(dāng)培養(yǎng)物OD600達(dá)到0.6 ～0.8 時(shí)，加入終濃度為1 g/L 的乳糖于37℃誘導(dǎo)16 h。離心收集菌體，超聲破壁后利用卵黃平板法和SDS-PAGE 鑒定分析重組蛋白［7-8］。

1.5 p-NPPC 法測(cè)定磷脂酶C 酶活力

對(duì)硝基磷酸膽堿(p-nitrophehylphosphoryl-choline，簡(jiǎn)稱p-NPPC)是卵磷脂的一種結(jié)構(gòu)類似物。PLC 可以分解p-NPPC 生成一種顯黃色的對(duì)硝基苯酚，對(duì)硝基苯酚在410 nm 處有最大吸收，可反映PLC水解p-NPPC 產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚的量，從而根據(jù)對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線定量計(jì)算出相應(yīng)磷脂酶C 活力［9-10］。

酶活單位定義為pH 7.2，37℃條件下，每分鐘水解p-NPPC 生成1 nmol 對(duì)硝基苯酚所需的酶量為1個(gè)活力單位(U)［11］。酶反應(yīng)體系:50mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)，10 mmol/L p-NPPC。100μL 的反應(yīng)系統(tǒng)中加入10μL 的酶樣品溶液，37℃反應(yīng)30 min［10］。

1.6 E. coil BL21(DE3)/pET28a-lm-plcB 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

誘導(dǎo)接種量、誘導(dǎo)劑添加時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等因素對(duì)產(chǎn)酶的影響隨重組蛋白的種類不同而有所不同。本實(shí)驗(yàn)通過改變單因子的方法對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，以p-NPPC 法獲得的酶活大小作為優(yōu)化參考標(biāo)準(zhǔn)。

1.6.1 誘導(dǎo)接種量的優(yōu)化

在培養(yǎng)基中分別接入1%、2%、3%、4%、5%的菌種，不同接種量分別做3 個(gè)平行。擴(kuò)培4 h 后添加終濃度為1 g /L 的乳糖開始誘導(dǎo)表達(dá)，37℃、200 r/min 誘導(dǎo)24h 后檢測(cè)發(fā)酵液OD600值，并取等體積的發(fā)酵液超聲破碎后測(cè)定酶活力，確定最適接種量。

1.6.2 誘導(dǎo)劑添加時(shí)間的優(yōu)化

分別在重組菌接種后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 h 添加終濃度為1 g /L 的乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，37℃、200 r/min 誘導(dǎo)24 h 后確定最適誘導(dǎo)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)方法同上，每個(gè)時(shí)間梯度設(shè)置3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1. 6. 3 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

添加乳糖至終濃度1 g /L 后分別在18、25、30、37℃對(duì)重組菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每個(gè)溫度梯度設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法同上，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最適誘導(dǎo)溫度。

1. 6. 4 誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化

在上述已優(yōu)化的誘導(dǎo)基礎(chǔ)上，添加乳糖至終濃度為1、2.5、5、8、10、15、20 g /L 進(jìn)行梯度誘導(dǎo)，不同的乳糖濃度設(shè)置3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法同上，根據(jù)結(jié)果確定最適誘導(dǎo)劑濃度。

1. 6. 5 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

在上述已優(yōu)化的誘導(dǎo)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，分別誘導(dǎo)4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30 h 后，檢測(cè)發(fā)酵液OD600值，并取等體積的發(fā)酵液，超聲破碎細(xì)胞后測(cè)定酶活力大小，確定最適誘導(dǎo)時(shí)間。不同的誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)置3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.7 磷脂酶C 脫膠效果

將植物毛油(大豆毛油、菜籽毛油、米糠毛油)于具塞三角燒瓶中水浴加熱到80 ℃，加入總毛油質(zhì)量0.5%，濃度45%(w/w)的檸檬酸溶液，在500 r/min攪拌20 min，進(jìn)行酸預(yù)處理。將經(jīng)過酸預(yù)處理的油樣冷卻至47℃，加入4% NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至5 。再加入油重1%的蒸餾水和油重1%的重組磷脂酶C，均勻混合后，在62℃下300 r/min 攪拌1 h，進(jìn)行酶反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后將油樣置于90℃水中加熱10 min 滅酶，再測(cè)定磷含量［12］。

油相pH 的測(cè)定:用50 mL 離心管取油水混合物40 g，在5 000 r/min 離心10 min，棄去上層油相，向沉淀中加入5 mL 的蒸餾水，充分?jǐn)嚢杌旌虾笤俅卧? 000 r/min 離心10 min，取離心管中水相用pH 計(jì)測(cè)定pH 值，經(jīng)校正后采用。油相pH 為5.0 左右時(shí)的經(jīng)驗(yàn)校正公式:pH 實(shí)際=pH 測(cè)定-0.3［13］。

磷含量的測(cè)定:將脫膠后的油樣于10 000 r/min下離心10 min，取5 g 上層油樣進(jìn)行磷含量測(cè)定。油脂中磷含量測(cè)定參照GB/T5537 -2008。

2 結(jié)果與分析

2.1 L. monocytogenes 基因組DNA 的提取及l(fā)mplcB 基因的制備

以L. monocytogenes 全基因序列為模板，以引物P1 和P2 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增出的DNA 片段在約810bp 處，與預(yù)期大小相符(圖2)。測(cè)序結(jié)果顯示目的片段與L. monocytogenes 的plc 基因序列(YP 005964174.1)相似度達(dá)到99%，蛋白質(zhì)序列相似度為100%。

圖2 lm-plcB 的PCR 鑒定Fig.2 PCR result of lm-plcB

2.2 重組表達(dá)載體pET28a-lm-plcB 的鑒定

對(duì)構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pET28a-lm-plcB 進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，在810bp 處有目的條帶;進(jìn)一步對(duì)pET28a-lm-plcB 進(jìn)行EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，分別獲得約5 300 bp 和約810 bp 的條帶(圖3)，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖3 pET28a-lm-plcB 的酶切鑒定Fig.3 Restriction enzyme digestion analysis pET28a-lm-plcB by EcoRⅠand NotⅠ

2.3 E. coil BL21(DE3)/pET28a-lm-plcB 誘導(dǎo)表達(dá)及產(chǎn)物活性鑒定

E. coil BL21(DE3)/pET28a-lm-plcB 經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后超聲破碎，12 000 r/min 分離上清液。利用卵黃硼砂平板分析重組PLC 的活性，結(jié)果顯示:E. coil BL21(DE3)/pET28a 在卵黃硼砂平板上沒有出現(xiàn)水解圈，重組PLC 產(chǎn)生乳白色水解圈，且添加10 mol/L Mg2+后水解圈明顯增大，說明該重組蛋白對(duì)天然磷脂底物具有PLC 活性，Mg2+對(duì)其分解天然底物的活性具有促進(jìn)作用(圖4)。

SDS-PAGE 電泳結(jié)果表明 E. coil (BL21)/pET28a-lm-plcB 表達(dá)了相對(duì)分子質(zhì)量約為30.4 kDa的重組蛋白，與預(yù)期大小相符(圖5)。

圖4 重組蛋白的活性檢測(cè)Fig.4 Analysis of recombinant PLC activity

圖5 重組PLC 的SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant PLC in E.coil BL21(DE3)/pET28a-lm-plcB

2.4 E. coil BL21(DE3)/pET28a-lm-plcB 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.4.1 誘導(dǎo)接種量的優(yōu)化

由圖6 可知，在接種量為4%時(shí)，重組菌產(chǎn)酶量達(dá)到最大，約159.1 U/mL，故最適接種量為4%。

2.4.2 誘導(dǎo)劑添加時(shí)間的優(yōu)化

圖6 不同接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of inoculation on cell density and PLC activity

由圖7 可知，在接種后2h 添加乳糖，重組菌產(chǎn)酶量達(dá)到最大值，約411.9 U/mL 左右。故乳糖添加時(shí)間為轉(zhuǎn)接后2 h。

圖7 乳糖添加時(shí)間對(duì)酶活力的影響Fig.7 Effect of lactose addion time on cell density and PLC activity

2.4.3 誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

如圖8，誘導(dǎo)溫度為25℃時(shí)，重組蛋白的酶活力達(dá)到最大，可達(dá)到431.5 U /mL 左右。故選取發(fā)酵產(chǎn)酶的誘導(dǎo)溫度為25℃。

圖8 添加乳糖時(shí)誘導(dǎo)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of lactose concentration on cell density and PLC activity

2.4.4 誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化

由圖9 可見，在乳糖濃度為2.5 g /L 時(shí)，重組菌產(chǎn)酶量達(dá)到最大，約633.1 U /mL 左右，故乳糖誘導(dǎo)劑的最適誘導(dǎo)濃度為2.5 g/L。

圖9 乳糖質(zhì)量濃度對(duì)酶活力的影響Fig.9 Effect of lactose concentration on cell density and PLC activity

2.4.5 誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

由圖10 可知，乳糖添加后26 h，重組蛋白的酶活力達(dá)到最大值，約為754.6 U /mL，故最適誘導(dǎo)時(shí)間為26 h。

圖10 添加乳糖時(shí)誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of lactose induction time on phospholipase activity

2.5 重組磷脂酶C 脫膠效果的初步研究

利用該重組PLC 對(duì)不同植物毛油進(jìn)行脫膠，最終將大豆毛油中的含磷量從216.67 mg/kg 下降到3.705 mg/kg，磷含量降低了98.40%;菜籽毛油中的含磷量從183.7 mg/kg 下降到4.503 mg/kg，磷含量比脫膠前降低了97.55%;米糠毛油中的含磷量從306.8 mg/kg 下降到50.191 mg/kg，磷含量比脫膠前降低了83.63%。

3 討論

本文對(duì)單增李斯特氏菌來源的lm-plcB 基因在大腸桿菌中進(jìn)行了重組表達(dá)，并首次應(yīng)用單增李斯特氏菌來源的重組PLC 對(duì)不同的植物毛油進(jìn)行脫膠，最終使大豆毛油和菜籽毛油的磷含量降低到了5 mg/kg以下，避免了傳統(tǒng)油脂精煉環(huán)節(jié)的脫酸處理，可以實(shí)現(xiàn)油脂的物理精煉。利用PLC 脫膠，油脂中的水化磷脂可以被水解生成DAG 和水溶性磷酸酯，DAG 作為油脂的固有組分可以伴隨油相被回收，避免了中性油的損失，大大降低了毛油煉耗率，較溫和的處理?xiàng)l件也顯著提高了油脂的品質(zhì)。因此，單增李斯特氏菌來源的重組磷脂酶C 在油脂工業(yè)中的應(yīng)用具有較大的經(jīng)濟(jì)意義和社會(huì)效益。

為了進(jìn)一步開發(fā)符合工業(yè)化生產(chǎn)的磷脂酶C 制劑，還需對(duì)該重組磷脂酶C 的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)一步深入研究，探索其底物特異性，針對(duì)不同毛油產(chǎn)品，開發(fā)混合型酶制劑，增強(qiáng)產(chǎn)品的適應(yīng)性，提升制劑的穩(wěn)定性。相信隨著PLC 結(jié)構(gòu)功能研究的不斷深入和油脂酶法脫膠技術(shù)的不斷完善，PLC 酶法脫膠將得到進(jìn)一步推廣，油脂精煉也將更加符合健康、環(huán)保和低耗的理念。

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