楊利博，鄭志永，詹曉北

(江南大學 生物工程學院糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

隨著全球能源危機的出現(xiàn)和原油價格的不斷飆升，生物柴油作為一種替代能源得到了蓬勃發(fā)展。甘油是生產(chǎn)生物柴油的主要副產(chǎn)物，每生產(chǎn)10 t 生物柴油，就有1 t 廢棄粗甘油產(chǎn)生［1］。因此，廢棄甘油的處理問題備受關(guān)注。而甘油可被作為優(yōu)良碳源，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)如單細胞蛋白、脂類、色素、多元醇、有機酸等多種高附加值產(chǎn)品［2］。因此，甘油作為一種儲量巨大及價廉易得的可再生資源受到越來越多的研究者的青睞。

赤蘚糖醇(erythritol)是多元醇的一種，學名1，2，3，4-丁四醇，因其具有吸濕性小，熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點，作為一種新型甜味劑和添加劑被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、化妝品和化工領(lǐng)域。赤蘚糖醇幾乎不被人體吸收，不會造成齲齒及血糖反應，被稱作“零熱量甜度劑”。商業(yè)化生產(chǎn)赤蘚糖醇主要以葡萄糖為底物，利用嗜高滲酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生，但發(fā)酵過程中會產(chǎn)生甘油、甘露醇或阿拉伯糖醇等副產(chǎn)物，增加下游分離的成本投入［3］。因此，尋找更為優(yōu)良的菌種和廉價底物是提升行業(yè)競爭力的重要途徑。解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一種非常規(guī)酵母，可很好地利用甘油作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇［4］，且處于高滲環(huán)境時，Y. lipolytica 會大量合成赤蘚糖醇以抵御高滲環(huán)境對自身的破壞，其機理可能是多元醇作為相容物質(zhì)，避免水分從胞內(nèi)快速流失，保持細胞質(zhì)膜的兩側(cè)的水活度。雖然高滲環(huán)境有利于赤蘚糖醇的積累［5］，但會抑制酵母生長，且過高的滲透壓會使發(fā)酵停滯，導致生產(chǎn)強度低下。因此，提升酵母細胞的耐高滲能力是提升赤蘚糖醇生產(chǎn)強度的關(guān)鍵。

氨基酸及其衍生物被廣泛認為常見的滲透保護物質(zhì)，其中甘氨酸、甘氨酸甜菜堿、脯氨酸、谷氨酸等作為滲透壓保護劑被普遍應用于高滲發(fā)酵體系［6］。脯氨酸可在多種微生物胞內(nèi)大量積累且對微生物幾乎沒有任何影響，因此脯氨酸被認為是最常用的滲透壓保護劑。甘氨酸是另一種重要的滲透壓保護劑，且已被證實其對Saccharomyces cerevisiae 的耐高滲能力具有顯著提升作用［7］。雖然S. cerevisiae 的滲透調(diào)節(jié)機制已被深入研究，但研究集中在闡明滲透調(diào)節(jié)及滲透響應機制等方面，很少有研究者將這些機理應用于優(yōu)化多元醇的發(fā)酵生產(chǎn)。本研究以甘油為底物，以Y. lipolytica 為發(fā)酵菌株，研究在高滲環(huán)境下，以甘氨酸、脯氨酸作為滲透壓保護劑是否可以提升酵母菌的抵御高滲脅迫能力，從而高效地轉(zhuǎn)化甘油生成赤蘚糖醇。

1 材料與方法

1.1 菌株

解脂耶氏酵母(Y. lipolytica)CICC 1675，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

斜面保藏培養(yǎng)基(g/L):甘油50.0，酵母膏10.0，瓊脂20，pH 6.0。

種子培養(yǎng)基(g/L):甘油50.0，酵母膏10.0，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO40.2，pH 6.0。

高滲發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油200.0，酵母膏1.0，尿素2.0，MgSO4·7H2O 1.0，KH2PO41.0，pH 3.0。

1.3 培養(yǎng)方法

種子液制備:250 mL 三角瓶中加入50 mL 種子培養(yǎng)基，接種1 環(huán)斜面菌體，30℃，250 r/min 旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)24 h。

搖瓶發(fā)酵實驗:250 mL 搖瓶中裝入30 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基，以10%的接種量接入上述種子液，30℃，250 r/min 旋轉(zhuǎn)搖床中發(fā)酵120 h，發(fā)酵完成后測定各發(fā)酵參數(shù)。

發(fā)酵罐發(fā)酵實驗:采用7L 機械攪拌發(fā)酵罐(BioFlo 115;New Brunswick Scientific Co. ，NJ，USA)，裝液量3L，接種量10%，攪拌轉(zhuǎn)速800 r/min，通氣量1.0 vvm，使用2.0 mol/L NaOH 維持發(fā)酵液pH 為3.0 ± 0.1，30℃下發(fā)酵，每隔6 ～12 h 取樣分析，至底物耗盡，發(fā)酵結(jié)束。

1.4 分析方法

菌體濃度測定:取500 μL 發(fā)酵液，10 000 × g 離心10 min，去離子水洗滌2 次，稀釋至10 mL，紫外分光光度計(model UV-2000;UNICO，Dayton，NJ)于600nm 下測定吸光度(OD600)。細胞干重測定是將待測樣品于105℃下干燥至恒重，測其干重。OD600與細胞干重見方程(1):

甘油、赤蘚糖醇濃度測定采用高效液相色譜(HPLC)法［8］。

胞內(nèi)氨基酸含量測定:取5.0 mL 發(fā)酵液，10 000 ×g離心10 min，棄上清液，使用去離子水洗滌菌體2 次，并將菌體重懸于0.4 mL 去離子水中，沸水浴裂解細胞10 min，冷卻至室溫，10 000 × g 離心10 min，取上清液0.22 μm 膜過濾，使用氨基酸分析儀(Agilent Technologies Co. ，Palo Alto，USA)測定氨基酸含量。

滲透壓值采用OSMOMAT 030 (Gonotec GmbH，Berlin，Germany)冰點滲透壓儀測定［9］。

2 結(jié)果與討論

2.1 初始滲透壓對Y. lipolytica 生長及產(chǎn)赤蘚糖醇影響

為了研究高滲透環(huán)境是否有利于赤蘚糖醇的積累，在搖瓶水平，采用0 ～40 g/L NaCl 作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，分別調(diào)節(jié)發(fā)酵體系的滲透壓為3.21 ± 0.15，3.54 ± 0.12，3.89 ± 0.10，4.17 ± 0.17，4.60 ±0.13 osmol/kg，發(fā)酵120 h，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 滲透壓對Y. lipolytica 菌體生長及赤蘚糖醇產(chǎn)量影響Fig.1 Effects of osmotic pressures on cell growth and erythritol production by Y. lipolytica

由圖1 可見，Y. lipolytica 對滲透壓作用敏感，隨著發(fā)酵體系初始滲透壓的提升，菌體量從3.21 ±0.15 osmol/kg 時的16.0 ± 0.4 g/L 降至4.06 ±0.13 osmol/kg 時的8.8 ± 0.3 g/L;但赤蘚糖醇產(chǎn)量卻隨著體系滲透壓的提升而增加，并在滲透壓為4.17 ± 0.17 osmol/kg 時達到最大值87.2 ± 2.9 g/L，產(chǎn)量比滲透壓為3.21 ± 0.15 osmol/kg 時增加了34.7 g/L?？梢?，合適的初始高滲對赤蘚糖醇的大量積累有促進作用。Ishizuka 等［10］和Park 等［11］報道較高的初始葡萄糖濃度有助于促進赤蘚糖醇合成;Tomaszewska 等［5］和田柳等［12］發(fā)現(xiàn)通過添加適量NaCl提升發(fā)酵液滲透壓可促進赤蘚糖醇的合成，與本研究結(jié)果一致。但同時發(fā)現(xiàn)過高的滲透壓會抑制菌體生長，導致發(fā)酵時間延長，赤蘚糖醇生產(chǎn)強度降低。因此，選擇4.17 ± 0.17 osmol/kg 為最適發(fā)酵初始滲透壓。

2.2 滲透壓對Y. lipolytica 胞內(nèi)氨基酸組成及含量的影響

為了進一步闡明不同高滲環(huán)境對Y. lipolytica 胞內(nèi)氨基酸組成及含量的影響，設(shè)計實驗如下:在搖瓶水平，使用NaCl 調(diào)節(jié)發(fā)酵液初始滲透壓分別為3.21± 0.15，3.54 ± 0.12，3.89 ± 0.10，4.17 ± 0.17，4.60 ± 0.13 osmol/kg，當菌種生長至指數(shù)后期(72h)時取樣測定Y. lipolytica 胞內(nèi)游離氨基酸含量，結(jié)果見表1。由結(jié)果可知，隨著初始滲透壓提高，胞內(nèi)總氨基酸含量逐漸提升，當滲透壓為4.60 ±0.13 osmol/kg 時，胞內(nèi)氨基酸總量比低滲透壓時(3.21 ± 0.15 osmol/kg)增加了52.7%。其中，脯氨酸含量提升了80.3%。Andreishcheva［13］等發(fā)現(xiàn)Y. lipolytica 在高鹽環(huán)境下胞內(nèi)甘油、游離氨基酸含量隨鹽濃度提升而增加，其中以脯氨酸和脂肪族氨基酸的增加最為明顯;Xu［6］等發(fā)現(xiàn)Torulopsis glabrata在高滲環(huán)境下胞內(nèi)氨基酸總量提升明顯，其中脯氨酸，甘氨酸提升最為顯著。

表1 不同滲透壓對胞內(nèi)游離氨基酸種類及含量的影響Table 1 Effects of osmotic pressure on the content of the intracellular free amino acids

2.3 外源添加甘氨酸和脯氨酸強化赤蘚糖醇生產(chǎn)

高滲環(huán)境下，氨基酸及其衍生物被廣泛認作胞內(nèi)抵御環(huán)境壓力的相容物質(zhì)，其中甘氨酸、甘氨酸甜菜堿、脯氨酸等作為滲透壓保護劑被普遍應用于高滲發(fā)酵體系［14］。由表1 所示，當發(fā)酵體系滲透壓提高時，Y. lipolytica 胞內(nèi)甘氨酸和脯氨酸合成量增加。為研究外源補充甘氨酸和脯氨酸是否有助于Y. lipolytica抵御高滲環(huán)境的生長抑制作用，促進赤蘚糖醇的快速合成而設(shè)計實驗如下:在搖瓶水平，使用NaCl 調(diào)節(jié)發(fā)酵體系滲透壓為最適滲透壓4.17 ± 0.17 osmol/kg，以未添加NaCl 的滲透壓(3.21 ± 0.15 osmol/kg)做對照，分別添加不同濃度0 ～50 mg/L 甘氨酸、脯氨酸，發(fā)酵時間96 h。結(jié)果見圖2。

從圖2A 可見，在低滲條件下，添加不同濃度的甘氨酸和脯氨酸對菌體生長沒有明顯的促進作用，發(fā)酵結(jié)束時，菌體量都維持在15.8 ± 0.5 g/L 左右;與對照組相比，隨著氨基酸濃度的增加，赤蘚糖醇產(chǎn)量有輕微下降，但都在50.0 g/L 以上。由以上結(jié)果可見，低滲環(huán)境對菌體生長無抑制作用，且低滲條件下添加外源氨基酸對赤蘚糖醇產(chǎn)量無促進作用。但受N 源濃度限值，最大菌體量維持在同一水平。

圖2 甘氨酸、脯氨酸對低滲(3.21 ± 0.15 osmol/kg)赤蘚糖醇發(fā)酵影響Fig.2 Effects of glycine and porline on erythritol fermentation at low osmotic pressure (3.21 ± 0.15 osmol/kg)

在高滲條件(圖3)下，菌體生長被明顯抑制，在未外源添加氨基酸的情況下，最大菌體量只有8.5 ±0.4 g/L 左右，但隨著外源氨基酸濃度的提升，菌體量也逐漸增加，且分別在添加30 mg/L 甘氨酸和40 mg/L 脯氨酸時達到15.2 ± 0.3 g/L 和15.3 ± 0.4 g/L，生長促進作用明顯，菌體量分別比未添加氨基酸時增加了82.6%和80.0%。赤蘚糖醇產(chǎn)量在添加30 mg/L 甘氨酸和40 mg/L 脯氨酸時達到最大，為88.0± 2.1 g/L 和85.9 ± 1.6 g/L，但隨著氨基酸濃度繼續(xù)提升赤蘚糖醇產(chǎn)量出現(xiàn)輕微下降。原因可能是外源氨基酸添加導致菌體生長速率加快，較多的碳源被菌體呼吸生成CO2而消耗，導致赤蘚糖醇產(chǎn)量輕微下降。此外，從圖3A、B 可看出，添加相同濃度的甘氨酸和脯氨酸時，甘氨酸在促進菌體生長和產(chǎn)物積累方面效果更為明顯，這與Thomas 等［7］發(fā)現(xiàn)甘氨酸比脯氨酸更有助于保持S. cerevisiae 在酒精發(fā)酵中的活性結(jié)果一致。外源添加氨基酸可協(xié)助酵母細胞抵御高滲環(huán)境的原因可能有如下兩點:(1)細胞暴露于高滲環(huán)境時，細胞會合成相容性物質(zhì)來抵御滲透壓破壞，但細胞自身合成的氨基酸濃度較低，不能充分滿足細胞抵御高滲破壞，因此，微生物會從外部環(huán)境吸收氨基酸并在胞內(nèi)積累，從而達到抵御高滲環(huán)境的目的;(2)氨基酸不僅可作為滲透壓保護劑在酵母胞內(nèi)積累，也可被酵母細胞作為C 源或N 源加以利用，從而促進細胞生長，該現(xiàn)象已經(jīng)在S. cerevisiae 得到證實［15］。因此，最終確定外源氨基酸添加量為甘氨酸30 mg/L，脯氨酸40 mg/L。

2.4 Y. lipolytica 轉(zhuǎn)運外源氨基酸抵御高滲脅迫

已有報道稱在高滲環(huán)境下，Y. lipolytica 會合成更多的游離氨基酸來抵御環(huán)境脅迫作用［13］。而外源添加甘氨酸和脯氨酸對高滲環(huán)境下菌體生長有良好的促進作用(圖3A)。因此，為驗證Y. lipolytica 是否從胞外轉(zhuǎn)運氨基酸至胞內(nèi)以增強細胞抵御高滲的能力，本實驗測定了不同高滲下(4.17 ± 0.17 osmol/kg，4.60 ± 0.13 osmol/kg)，外源添加甘氨酸和脯氨酸時，胞內(nèi)甘氨酸和脯氨酸含量的變化，以考察氨基酸轉(zhuǎn)運對細胞耐高滲作用的影響，結(jié)果見表2。

圖3 甘氨酸、脯氨酸對高滲(4.17 ± 0.17 osmol/kg)赤蘚糖醇發(fā)酵影響Fig.3 Effects of glycine and porline on erythritol fermentation at high osmotic pressure (4.17 ± 0.17 osmol/kg)

當添加相同濃度的外源甘氨酸和脯氨酸時，隨著發(fā)酵初始滲透壓的提升，胞內(nèi)甘氨酸和脯氨酸的含量都有不同程度的增加。此外，在相同滲透壓下，隨著外源氨基酸添加量的提升，胞內(nèi)氨基酸含量也快速增加。當在滲透壓為4.17 ± 0.17 osmol/kg 時，添加30 mg/L 甘氨酸，胞內(nèi)甘氨酸含量比未添加是時增加了884.6%，而添加40 mg/L 脯氨酸使胞內(nèi)氨基酸含量比未添加時增加了407.5%。隨著外源氨基酸添加量的提升，胞內(nèi)甘氨酸積累量的提升比脯氨酸更顯著，而在S. cerevisiae 中，甘氨酸也是滲透保護劑甜菜堿的前體物質(zhì)［7］，甘氨酸濃度的提升有助于甜菜堿的大量合成，這可能是導致甘氨酸比脯氨酸更有利于提升Y. lipolytica 耐高滲能力的原因。

2.5 甘氨酸和脯氨酸提升赤蘚糖醇生產(chǎn)強度

在7 L 發(fā)酵罐水平，調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始滲透壓為4.17 ± 0.17 osmol/kg，加入30 mg/L 甘氨酸和40 mg/L 脯氨酸，底物耗盡時發(fā)酵結(jié)束。由結(jié)果(圖4，表3)可見，與未添加氨基酸時發(fā)酵過程相比，添加30 mg/L 甘氨酸和40 mg/L 脯氨酸可顯著促進菌體生長速度和縮短發(fā)酵時間。發(fā)酵結(jié)束時，生物量增至20.3 ± 0.7 g/L，比未添加氨基酸時增加了4.63%;而發(fā)酵時間由108 h 縮短至90 h。此外，甘油消耗速率提升明顯(圖4 B)，由1.77 ± 0.04 g/(L·h)增加至2.13 ± 0.03 g/(L·h)，增加了20.3%;而赤蘚糖醇生產(chǎn)強度也顯著提升，由0.83 ±0.03 g/(L·h)提升至1.04 ± 0.05 g/(L·h)，提升了25.3%。但赤蘚糖醇最終產(chǎn)量及得率與未添加氨基酸時相比提升并不明顯，僅為4.12%和4.26%，原因可能是滲透壓是決定赤蘚糖醇最終濃度及底物轉(zhuǎn)化率的重要因素，當發(fā)酵液初始滲透壓處于同一水平時，添加滲透壓保護劑只提升了Y. lipolytica 抵抗高滲抑制生長的能力，并不能顯著提升赤蘚糖醇的轉(zhuǎn)化率。

表2 滲透壓對氨基酸轉(zhuǎn)運的影響Table 2 Effects of osmotic pressure on the transport of glycine and proline

圖4 高滲條件下添加滲透壓保護劑對赤蘚糖醇發(fā)酵影響Fig.4 Effect of osmoprotectants on erythritol fermentation by Y. lipolytica at 4.17 ± 0.17 osmol/kg

表3 高滲條件下滲透壓保護劑添加前后赤蘚糖醇發(fā)酵參數(shù)對比Table 3 Comparison of parameters in erythritol fermentation by Y. lipolytica at 4.17 ± 0.17 osmol/kg with and without osmoprotectants addition

3 結(jié)論

(1)以甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)赤蘚糖醇過程中，初始滲透壓是決定赤蘚糖醇最終產(chǎn)量及得率的重要因素，高滲對赤蘚糖醇合成有促進作用，但會抑制Y. lipolytica 的生長。本研究中，最適初始滲透壓為4.17± 0.17 osmol/kg。

(2)不同的初始滲透壓可改變胞內(nèi)游離氨基酸的組成及含量，滲透壓的提升會促進胞內(nèi)游離氨基酸總量的增加。當添加外源氨基酸時，Y. lipolytica 會將其轉(zhuǎn)運至胞內(nèi)并大量積累，以提升自身耐高滲能力。

(3)甘氨酸和脯氨酸是Y. lipolytica 良好的滲透壓保護劑，添加30 mg/L 的甘氨酸和40 mg/L 的脯氨酸可有效提升赤蘚糖醇的生產(chǎn)強度，但對于提升甘油到赤蘚糖醇轉(zhuǎn)化率效果不明顯。

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