李攀 顧振鵬 劉順振＊ 劉晶晶 代培培 劉志慧

（1．濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科二病區(qū)，＊口腔科，山東濱州 256603；2．濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東煙臺(tái) 264100）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）的發(fā)生、發(fā)展與雌激素的暴露密切相關(guān)，是雌激素依賴性疾病［1］。芳香化酶（cytochrome P450 19，CYP19）和兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（catechol－O－methyltransferase，COMT）是雌激素合成和代謝過程中的關(guān)鍵酶。因此，CYP19、COMT基因多態(tài)性可能與EMs發(fā)病有關(guān)。本研究采用高分辨率溶解曲線（high resolution melting，HRM）分析技術(shù)，佐以聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism，PCR－RFLP）分析技術(shù)，研究CYP19基因240A／G、COMT基因1947G／A位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與山東省濱州地區(qū)漢族婦女EMs的關(guān)系。

1 資料與方法

1．1 一般資料 2011年9月—2012年5月在濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科行手術(shù)治療并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)的EMs患者80例（包括卵巢巧克力囊腫30例、子宮腺肌癥50例）為EMs組；選擇同期行婦科手術(shù)并經(jīng)術(shù)后病理排除EMs的患者40例為對照組。兩組患者者均為漢族，且年齡、體質(zhì)量、妊娠次數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）?；颊呔炇鹬橥鈺山M患者術(shù)后第3天取清晨空腹肘靜脈血3mL，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，保存于－80℃冰箱。

1．2 方法

1．2．1 全血DNA的提取及檢測 采用酚－氯仿提取法提取全血DNA，并用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定，紫外線分光光度儀測定DNA純度均大于1．7。

1．2．2 PCR 擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì) 參考相關(guān)文獻(xiàn)［2－3］設(shè)計(jì)PCR引物，序列如下：（1）CYP19基因240A／G的 上 游 引 物 5＇－AGTAACACAGAACAGTTGCA－3＇，下游引物5＇－TCCAGACTCGCATGAATTCTCCGTA－3＇；（2）COMT 基因1947G／A 的上游引物5＇－T CGTGGACGCCGTGATTCAGG－3＇，下 游 引 物 5＇－AGGTCTGACAACGGGTCAGGC－3＇。以上引物均由上海生物工程有限公司合成。

1．2．3 PCR擴(kuò)增條件 （1）CYP19基因240A／G位點(diǎn)PCR反應(yīng)條件：95℃2min；95℃30s、51℃30s、72℃30s，共32個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。（2）COMT基因1947G／A 位點(diǎn)PCR反應(yīng)條件：95℃2min；95℃30s、59℃30s、72℃30s，共32個(gè)循環(huán)；72℃10min，4℃保存。兩者PCR產(chǎn)物均采用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1．2．4 采用HRM技術(shù)對基因多態(tài)性分型 （1）將9μL PCR產(chǎn)物與1μL LC Green于暗室中依次加入96孔PCR反應(yīng)板并混勻，用1滴礦物油封液面；（2）95℃30s，25℃30s，1個(gè)循環(huán)，保存于4℃；（3）將96孔板4000r／min離心30s，放入 Lightscanner儀器中，采用軟件分析溶解曲線，得出基因型，并與酶切結(jié)果相互佐證。CYP19 240A／G、COMT 1947G／A各基因型見圖1～2。

1．2．5 限制性內(nèi)切酶酶切 （1）CYP19 240A／G酶切反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物3μL，10×T buffer 2μL，0．1%BSA 2μL，限制性核酸內(nèi)切酶RsaⅠ1μL（10 U／μL），滅菌雙蒸水12μL，共20μL，37℃水浴1 h；（2）COMT 1947G／A酶切反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物5 μL，10×G buffer 2μL，內(nèi)切酶 N1aⅢ0．5μL（5 U／μL），滅菌雙蒸水12．5μL，共20μL，37℃水浴16h。以上兩組酶切產(chǎn)物均用3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，觀察酶切條帶，判斷基因型。

圖1 CYP19 240A／G各基因型溶解曲線

圖2 COMT 1947G／AG各基因型溶解曲線

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對兩組樣本的CYP19和COMT基因頻率進(jìn)行Hardy－Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。對兩組樣本人群CYP19和COMT基因型及各等位基因分布頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)算比值比（odds ratio，OR）及95%可信區(qū)間（confidence interval，CI），以分析CYP19和COMT突變基因型及突變基因型與EMs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 采用HRM分析儀得到的基因型統(tǒng)計(jì) （1）CYP19 240A／G：EMs組 AA 17例，AG 41例，GG 22例；對照組 AA 22例，AG 13例，GG 5例；（2）COMT 1947G／A：EMs組GG 46例，GA 28例，AA 6例；對照組GG 24例，GA 12例，AA 4例。以上結(jié)果與酶切結(jié)果基本一致。對兩基因在EMs組和對照組中的基因型頻率進(jìn)行Hardy－Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，結(jié)果P均＞0．05，可進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2．2 CYP19 240A／G各基因型及等位基因分布頻率與EMs的關(guān)系 EMs組各基因型及等位基因分布頻率與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝14．096，P＝0．001；χ2＝12．803，P＝0．001），等位基因G突變可使EMs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加2．809倍，95%CI為1．580～4．992。EMs組攜帶G等位基因突變的基因型（AG＋GG）與野生型（AA）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝13．846，P＝0．0001），攜帶 AG 和GG基因型的婦女EMs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加了4．529倍，95%CI為1．992～10．300。見表1～3。

2．3 COMT 1947G／A各基因型及等位基因分布頻率與EMs的關(guān)系 EMs組各基因型及等位基因分布頻率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），表明COMT 1947G／A位點(diǎn)等位基因突變與EMs發(fā)病無相關(guān)性。EMs組攜帶A等位基因突變的基因型（GA＋AA）分別與野生型（GG）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．793），這表明與野生型（GG）相比，攜帶A等位基因的基因型（GA＋AA）不能增加EMs的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。見表1～3。

表1 EMs組及對照組CYP19、COMT各基因型分布頻率比較n（%）

表2 EMs組及對照組CYP19、COMT各等位基因分布頻率比較n（%）

表3 EMs組與對照組CYP19、COMT突變型和野生型比較n（%）

3 討 論

自1980年Simpson等首次對EMs進(jìn)行遺傳學(xué)研究，證明該病可能有家族史后，國內(nèi)外學(xué)者開始對引起EMs遺傳學(xué)改變的因素進(jìn)行研究。有研究［4］表明，EMs具有家族聚集性，患者一級(jí)親屬發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是無家族史者7倍，單卵雙胎孿生姐妹發(fā)病率高達(dá)75%。近幾年的研究［5］結(jié)果表明，EMs是一種由多個(gè)基因位點(diǎn)與環(huán)境、激素、免疫等因素相互作用所致的疾病。

HRM分析技術(shù)是近年來國際上新興的一種檢測SNP、基因突變及基因分型的工具。其原理如下：雙鏈DNA熒光染料與PCR產(chǎn)物結(jié)合后，升溫過程中SNP位點(diǎn)因不匹配會(huì)使雙鏈DNA解開，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光強(qiáng)度與時(shí)間曲線的關(guān)系就可以區(qū)分不同SNP位點(diǎn)和不同基因型。HRM分析技術(shù)具有操作簡便、特異性高、速度快、對樣品無污染等優(yōu)點(diǎn)。

本研究應(yīng)用HRM分析技術(shù)研究CYP19 240 A／G、COMT 1947G／A位點(diǎn)的SNP與山東省濱州地區(qū)漢族婦女EMs發(fā)病的相關(guān)性。結(jié)果顯示，EMs組CYP19 240A／G位點(diǎn)各基因型及等位基因分布頻率與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），其中等位基因G突變可使EMs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加2．809倍。EMs組攜帶G等位基因突變的AG和GG基因型的婦女EMs發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加4．529倍。EMs組COMT 1947G／A位點(diǎn)各基因型及等位基因分布頻率與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），說明COMT 1947G／A位點(diǎn)多態(tài)性與EMs發(fā)病無相關(guān)性。攜帶A等位基因突變的基因型（GA＋AA）并不增加EMs的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

采用HRM分析SNP是近年來新興的檢測手段，其特異性高、耗時(shí)短，適用于大樣本統(tǒng)計(jì)研究。本實(shí)驗(yàn)所研究的基因種類局限，且樣本量較少，在統(tǒng)計(jì)中難免出現(xiàn)偏差，僅代表部分濱州漢族婦女的情況。在今后的研究中，應(yīng)采取多地區(qū)、多種族、大樣本、多基因聯(lián)合的研究，以更好的研究EMs的發(fā)病機(jī)制。

［1］ Kitawaki J，Kado N，Ishihara H，et al．Endometriosis：the pathophysiology as an estrogen－dependent disease［J］．J Steroid Biochem Mol Biol，2002，83（1－5）：149－155．

［2］ Miyoshi Y，Iwao K，Ikeda N，et al．Breast cancer risk associated with polymorphism in CYPl9Japanese women［J］．Int J Cancer，2000，89（4）：325－328．

［3］ Kunuqi H，Nanko S，Ueki A，et al．High and low activity alleles of Catechol－O－methyltransferase gene：ethnic difference and possible association with Parkinson’s disease［J］．Neurosci Lett，1997，221（2－3）：202－204．

［4］ 樂杰．婦產(chǎn)科學(xué)［M］．第7版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：326－327．

［5］ Bischoff F，Simpson JL．Genetic basis of endometriosis［J］．Ann NY Acad Sci，2004，1034：284－299．