李衛(wèi) 何援利 米登海

（1．南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州 510282；2．甘肅省第二人民醫(yī)院腫瘤科，甘肅蘭州 730000）

錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）主要存在于真核細(xì)胞、原核細(xì)胞及線粒體基質(zhì)中，它作為一種重要的抗氧化劑在機(jī)體防御疾病的過程中起著重要作用。天然的MnSOD分子質(zhì)量大、在體內(nèi)半衰期短、穩(wěn)定性差、易被蛋白水解，且長期應(yīng)用可誘發(fā)免疫和過敏反應(yīng)，這些不足限制了其臨床應(yīng)用［1］。文獻(xiàn)［2－4］報道，人工合成的MnSOD即錳超氧化物歧化酶模擬化合物（mimics of manganese superoxide dismutase，MnSODm）對敏感和耐藥的白血病細(xì)胞的活性具有較強抑制作用。我們的試驗也表明，MnSODm對人卵巢上皮性癌細(xì)胞株SKOV3的裸鼠移植瘤有治療作用。本實驗研究MnSODm對SKOV3細(xì)胞的凋亡效應(yīng)，并探討其可能的機(jī)制。

1 資料與方法

1．1 材料 MnSODm由蘭州大學(xué)化工學(xué)院劉偉生教授提供，分子式為C40H57Mn2N9O21；SKOV3細(xì)胞株購自韓國細(xì)胞銀行，RPMI1640培養(yǎng)基為美國GibcoBRL公司產(chǎn)品；新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所?；罴?xì)胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit－8，CCK－8）購自日本同仁化學(xué)研究所，生物潔凈安全柜購自江蘇蘇凈公司，碘化丙啶（propidium iodide，PI）單染試劑盒購自美國Sigma公司。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng) SKOV3細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%二氧化碳、飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3d換液1次，待細(xì)胞長滿80%～90%進(jìn)行傳代。

1．2．2 細(xì)胞增殖能力和活性的測定 取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞，以0．25%胰酶消化，計數(shù)并接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×103個／孔，加入 MnSODm（分為3個濃度梯度，即0、10、50μg／mL，0μg／mL為空白對照組）。分別培養(yǎng)0、24、48和72h后，按照CCK－8試劑盒說明書，在上述時間點，每孔加入10μL的CCK－8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h，用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度，即A值。

1．2．3 PI單染檢測凋亡細(xì)胞 加入不同濃度梯度的 MnSODm（0、10、50μg／mL）處理SKOV3細(xì)胞72h后，去除上清液，加入200μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，離心并去除PBS，加入冰預(yù)冷的70%乙醇固定，4℃放置24h，離心棄去固定液，加入100μL核糖核酸酶（RNase）和PI染液，4℃避光30min，熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞變化。

1．2．4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 SKOV3細(xì)胞經(jīng)不同濃度梯度（0、10、50μg／mL）MnSODm處理0、24、48、72h后，在倒置顯微鏡下觀察活細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)的改變。

1．2．5 caspase3／7 活性檢測 將對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞加于96孔培養(yǎng)板中，依據(jù) MnSODm的不同濃度（0、10、50μg／mL）將其分為3組，分別培養(yǎng)72h，將caspase3／7底物和PBS混合后取100 μL加入以上各孔，37℃反應(yīng)30min。用熒光分光光度計分析。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13．0軟件處理數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間分析比較采用t檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 MnSODm處理SKOV3后細(xì)胞的增殖能力和活性 MnSODm對SKOV3細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，對SKOV3細(xì)胞活性亦有明顯抑制作用。見表1。

表1 不同濃度MnSODm對SKOV3細(xì)胞增殖能力和活性及caspase3／7活性的影響（±s，n）

表1 不同濃度MnSODm對SKOV3細(xì)胞增殖能力和活性及caspase3／7活性的影響（±s，n）

注：與同時間0μg／mL濃度組比較，＊P＜0．01

MnSODm（μg／mL） A值0h 24h 48h 72h 72h細(xì)胞活性率（%） 72hCaspase3／7活性（RFU）0 0．567±0．021 0．929±0．013 1．457±0．038 1．910±0．033 100．0±1．7 2 618±247 10 0．567±0．021 0．832±0．015＊ 1．100±0．039＊ 1．290±0．045＊ 67．5±2．4＊ 2 753±259 50 0．567±0．021 0．621±0．027＊ 0．558±0．044＊ 0．318±0．018＊ 16．6±0．9＊2 474±221

2．2 細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的變化 在熒光倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，表現(xiàn)為細(xì)胞伸展、透亮且折光性好；而10、50μg／mL Mn－SODm處理后的細(xì)胞伸展度降低，部分細(xì)胞體積變小、皺縮，折光性差。見圖1。

2．3 PI染色檢測MnSODm對SKOV3細(xì)胞凋亡的影響 空白對照組細(xì)胞核呈圓形，邊緣清晰，染色均勻；而10、50μg／mL MnSODm處理的細(xì)胞核邊緣不規(guī)則，染色質(zhì)凝集，著色較重，核固縮，核著色強陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于空白對照組。見圖2。

圖1 MnSODm作用SKOV3細(xì)胞72h后細(xì)胞大體觀

2．4 不同濃度 MnSODm對caspase－3／7活性的影響 SKOV3細(xì)胞經(jīng)10和50μg／mL MnSODm處理72h后，caspase－3／7的活性與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。見表1。

圖2 PI染色后熒光顯微鏡下凋亡細(xì)胞的改變

3 討 論

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的含銅、錳、鐵等金屬離子的酶，它能夠有效清除活性氧以及氧化過程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基（O2－·），是生物體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線［5］。

MnSOD過量表達(dá)在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中可抑制細(xì)胞生長，其機(jī)制尚不明確。目前認(rèn)為，細(xì)胞氧化還原狀態(tài)失衡引起細(xì)胞生長障礙，MnSOD過量表達(dá)使線粒體中的減少，如果分解H2O2的酶未相應(yīng)增加，H2O2濃度將會增高，引起細(xì)胞代謝障礙和生長抑制。高濃度的H2O2和一氧化氮（NO）能夠協(xié)同抑制腫瘤生長，原因在于NO在H2O2存在下生成羥自由基（·OH），增加了單鏈 DNA 損傷［6］。MnSOD過量表達(dá)時，谷胱甘肽過氧化物酶和H2O2酶代償性增加，NO可能通過抑制H2O2酶的作用而減少H2O2的分解，維持 MnSOD過量表達(dá)，使H2O2處于高水平狀態(tài)。MnSOD過量表達(dá)使細(xì)胞對谷胱甘肽（glutathion，GSH）合成阻滯劑—丁胱亞磺酰亞胺的敏感性增加，并使H2O2產(chǎn)生增加，使還原性與氧化性谷胱甘肽（GSSG）的比值即GSH／GSSG減少，這可能與NO敏感性亢進(jìn)有關(guān)。

Bernard等［7］研究顯示，MnSOD過量表達(dá)可清除腫瘤壞死因子α（TNF－α）誘導(dǎo)產(chǎn)生的而使細(xì)胞凋亡逃逸，但細(xì)胞內(nèi)H2O2蓄積后則會抑制細(xì)胞的增生并促進(jìn)其凋亡，當(dāng)MnSOD轉(zhuǎn)化的H2O2超過MnSOD清除的能力時，將會導(dǎo)致由細(xì)胞色素C及caspase－3、6、8、9啟動的細(xì)胞凋亡。因此，MnSOD過量表達(dá)對腫瘤的保護(hù)或抑制作用受之間平衡的制約。MnSOD不僅可以通過調(diào)節(jié)平衡而抑制或促進(jìn)細(xì)胞增殖，還可以通過調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡［8］。

本研究結(jié)果顯示，MnSODm有促進(jìn)SKOV3細(xì)胞凋亡的作用。MnSODm通過線粒體途徑和死亡受體途徑激發(fā)caspase家族活性，從而誘導(dǎo)敏感和耐藥的白血病細(xì)胞凋亡［3］。caspase家族成員以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞內(nèi)，caspase的活化途徑有線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。上述通路最終激活caspase－3、7、6、8、9，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但本實驗結(jié)果表明，MnSODm處理后的SKOV3細(xì)胞中caspase－3／7的活性與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），說明MnSODm并非通過激活caspase－3／7而誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)SKOV3凋亡的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

［1］ Kr?mer R．The pharmaceutical potential of manganese－based superoxide dismntase mimics［J］．Angew Chem Int Engl，2000，39（24）：4469－4470．

［2］ 安嫻，魏虎來，祁萍，等．MnSOD模擬化合物誘導(dǎo)人白血病多藥耐藥 K562／ADM 細(xì)胞凋亡［J］．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2008，16（5）：703－706．

［3］ 范臨蘭，魏虎來，竇偉，等．MnSOD模擬化合物通過線粒體途徑誘導(dǎo)K562／ADM細(xì)胞凋亡［J］．第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2008，29（24）：2248－2251．

［4］ 范臨蘭，魏虎來，竇偉，等．錳超氧化物歧化酶模擬化合物誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究［J］．中國藥理學(xué)通報，2009，25（10）：1363－1366．

［5］ Ho JC，Chan－Yeung M，Ho SP，et al．Disturbance of systemic antioxidant profile in nonsmall cell lung carcinoma［J］．Eur Respir J，2007，29（2）：273－278．

［6］ Kim KH，Rodriguez AM，Carrico PM，et al．Potential mechanisms for the inhibition of tumor cell growth by manganese superoxide dismutase［J］．Antioxid Redox Signal，2001，3（3）：361－373．

［7］ Bernard D，Monte D，Vandenbunder B，et al．The c－Rel transcription factor can induce and inhibit apoptosis in the same cells via the uqregulation of MnSOD［J］．Oncogene，2002，21（28）：4392－4402．

［8］ Zhang Y，Gu J，Zhao L，et al．Complete elimination of colorectal tumor xenograft by combinde manganese superoxide dismutase with tumor necrosis factor－related apoptosis－inducing ligand gene virotherapy［J］．Cancer Res，2006，66（8）：4291－4298．