呂國偉 朱繼 籍新潮 萬偉峰 徐睿

（重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，重慶 400016）

目前，越來越多的研究［1］表明，蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）對早期腦損傷（early brain injury，EBI）的發(fā)展起重要作用，尤其是SAH后急性腦血管痙攣（cerebral vasospasm，CVS）的發(fā)生及痙攣程度與患者病情進展的嚴重程度及其預后密切相關(guān)。引起早期急性CVS的病理因素有很多，如紅細胞破壞后釋放血紅蛋白、內(nèi)皮細胞受損后一氧化氮釋放減少、血管壁炎性反應、血管平滑肌細胞內(nèi)皮素受體激活、血管平滑肌細胞及內(nèi)皮細胞凋亡等，但其具體機制仍不明確［2－6］。含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（a disintegrin－like and metalloproteinase with thrombospondin type 1motifs，ADMTS－1）是一種新近發(fā)現(xiàn)的基質(zhì)金屬蛋白酶。研究［7］發(fā)現(xiàn)，ADAMTS－1與神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有望成為多種神經(jīng)損傷的標志蛋白及藥物治療靶點。本課題通過研究大鼠SAH后早期基底動脈中ADAMTS－1的表達及其與CVS的關(guān)系，探討ADAMTS－1在SAH后EBI中的作用。

1 資料與方法

1．1 實驗動物與主要試劑 健康成年雄性SD大鼠108只，體質(zhì)量250～300g，隨機分為假手術(shù)組（sham組，n＝18）和SAH 組（n＝90）。SAH 組隨機分為SAH 6h、12h、24h、48h、72h5個亞組，每個亞組各18只。sham組及SAH組各亞組中的6只SD大鼠用來檢測基底動脈 ADAMTS－1的mMRA表達，6只用來檢測ADAMTS－1蛋白表達，6只用來測量基底動脈管徑及管壁厚度。ADAMTS－1抗體購自美國Santa Cruz公司；Trizol試劑盒、實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應（RTPCR）檢測試劑盒購自日本Takara公司。

1．2 建立SAH模型 根據(jù)文獻［8］報道，采用改良的視交叉池注血法建立大鼠SAH模型。用3．5%水合氯醛（10mL／kg）將大鼠麻醉后，將其固定于腦立體定向儀，局部剪毛消毒后沿顱頂正中矢狀線切開皮膚，鈍性分離肌肉及骨膜后在冠狀縫前5．0cm、中線旁開3．0cm處，用牙科鉆鉆孔。顯露額極，以4號針頭挑破硬腦膜，見清亮腦脊液流出時，將PE10導管尖端從額極緊貼前顱窩底蛛網(wǎng)膜下腔向雙耳連線中點送入約10mm。經(jīng)大鼠股動脈抽取自體動脈血300 μL，經(jīng)PE10導管15s內(nèi)緩慢注入，拔出導管，以骨蠟封閉骨孔，縫合頭皮并消毒后維持頭低位30min。sham組大鼠按以上方法操作，但在視交叉池內(nèi)注入等量0．9%氯化鈉液。

1．3 檢測大鼠基底動脈 ADAMTS－1mRNA 按Trizol試劑盒說明書提取基底動脈總RNA。采用兩步法RT－PCR試劑盒配置反應體系。ADAMTS－1及3－磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物均由日本Takara公司設計并合成。ADAMTS－1上游引物為gataagtgtggcgtttgtggag，下 游 引 物 為 gatggtcaggggttctttgagt，擴增片段長度為336bp。內(nèi)參照GAPDH上游引物為gtgctgagtatgtcgtggagtct，下游引物為gtggaagaatgggagttgctgt，擴增片段長度為610bp。將RT－PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下攝照，比較電泳條帶相對光密度值。

1．4 提取基底動脈蛋白 SAH各亞組大鼠于相應時間點、sham組大鼠于72h迅速斷頭取腦，分離基底動脈并置于液氮保存。之后，取出基底動脈，將其置于1．5mL EP管中，加入全細胞蛋白裂解液后用電動勻漿器吹打5s，然后于4℃以12 000r／min離心5min，收集上清液，保存于－80℃冰箱中備用。

1．5 蛋白質(zhì)印跡（Western－blot）法及 RT－PCR法檢測基底動脈ADAMTS－1蛋白及mRNA的表達 按常規(guī)方法進行

1．6 基底動脈組織形態(tài)學觀察 分別在基底動脈大腦后動脈處、基底動脈中段、椎動脈匯合處取材，制成5μm厚度切片，進行HE染色。觀察基底動脈形態(tài)變化，參考文獻［9］中的方法分別計算3個層面的管腔直徑，取其平均值；在高倍鏡（10×40）下測量基底動脈管壁厚度，取3個層面的平均值。

1．7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差數(shù)法檢驗（least significant difference，LSD）。變量之間采用Pearson相關(guān)分析檢驗。檢驗水準ɑ＝0．05。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2．1 大鼠基底動脈ADAMTS－1mRNA表達 與sham組相比較，SAH 6h亞組大鼠基底動脈ADAMTS－1的mRNA表達的差異無統(tǒng)計學意義（P＝0．24）；SAH 12h亞組大鼠基底動脈 ADAMTS－1mRNA表達增高（P＝0．008）；SAH 24h亞組基底動脈 ADAMTS－1mRNA 表 達 達到高峰 （P＝0．003）；SAH 48h 亞組基底 動脈 ADAMTS－1的mRNA表達較SAH 24h亞組開始下降（P＝0．005）；72h亞組基底動脈 ADAMTS－1mRNA 表達降至最低（P＝0．007），見圖1。

圖1 sham組及SAH各亞組大鼠基底動脈ADAMTS－1mRNA表達水平比較

2．2 大鼠基底動脈 ADAMTS－1蛋白表達 與sham組相比較，SAH 6h亞組大鼠基底動脈ADAMTS－1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＝0．266）；SAH 12h亞組大鼠ADAMTS－1蛋白表達開始升高（P＝0．007），24h亞組達到高峰（P＝0．003），在48h亞組開始下降（P＝0．005），72h亞組仍維持在較高水平（P＝0．008），見圖2～3。

2．3 大鼠基底動脈光鏡下的形態(tài)學觀察sham組大鼠基底動脈內(nèi)膜光滑完整，無褶皺。與sham組大鼠相比較，SAH 6h亞組大鼠基底動脈管壁厚度和管腔直徑的差異無統(tǒng)計學意義（管壁厚度P＝0．302；管腔直徑P＝0．233）；SAH 12h亞組大鼠基底動脈內(nèi)膜開始出現(xiàn)褶皺，管壁增厚（P＝0．006），管腔縮?。≒＝0．004）；24h亞組大鼠基底動脈痙攣最明顯，內(nèi)膜明顯皺縮，管壁顯著增厚（P＝0．002），管腔顯著變小（P＝0．001）；48h亞組大鼠基底動脈內(nèi)膜皺縮減輕，管腔較24h亞組增大（P＝0．007），管壁較24h亞組變?。≒＝0．006）；72h亞組大鼠基底動脈內(nèi)膜未見明顯褶皺，管壁進一步變?。≒＝0．009），管腔顯著增大（P＝0．007），見圖4～6。

圖2 Western－blot顯示大鼠基底動脈ADAMTS－1蛋白表達水平

圖3 sham組及SAH各亞組大鼠基底動脈ADAMTS－1蛋白表達比較

圖4 sham組及SAH組各亞組大鼠基底動脈形態(tài)學比較

圖5 sham組及SAH各亞組大鼠基底動脈校正管腔直徑（μm）比較

圖6 sham組及SAH各亞組大鼠基底動脈校正管壁厚度（μm）比較

2．4 SAH后早期基底動脈ADAMTS－1蛋白表達與急性CVS的關(guān)系 統(tǒng)計學分析顯示，大鼠SAH后早期基底動脈ADAMTS－1蛋白表達與急性CVS呈正相關(guān)（r＝0．916，P＝0．003）。

3 討 論

自發(fā)性SAH是發(fā)病率及死亡率均較高的急性出血性腦血管綜合征，50%以上是由顱內(nèi)動脈瘤破裂引起，又稱動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血。再出血及SAH后遲發(fā)性腦血管痙攣（delayed cerebral vasospasm，dCVS）而導致的遲發(fā)性缺血性神經(jīng)功能障礙（delayed ischemic neurological deficits，DIND）是導致患者死亡或殘疾的最主要原因。尼莫同等鈣離子拮抗劑及內(nèi)皮素受體抑制劑的應用雖能明顯緩解CVS，但不能降低aSAH患者的死亡率。Cahill等［10］匯總大量的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SAH后EBI的發(fā)生及嚴重程度在很大程度上影響SAH患者的預后。SAH后急性CVS可導致腦血流量（cerebral blood flow，CBF）急劇下降，腦灌注壓也隨之降低，大腦發(fā)生局部或彌漫性的缺血、缺氧性改變，這在EBI的病理過程中起著重要的作用。ADAMTS－1與ADAMTS家族其他成員一樣，具有血小板反應素基序（thrombospondin，TSP），屬于分泌型蛋白，其被分泌后可通過C末端3個TSP重復序列和間隔區(qū)錨定在細胞外基質(zhì)中，并通過降解細胞外基質(zhì)蛋白參與多種病理生理過程。研究［11］發(fā)現(xiàn)，ADAMTS－1能夠酶解血管基質(zhì)蛋白，促進血管平滑肌的增殖和移位，從而參與動脈血管壁的損傷；另外，ADAMTS－1還可通過其C－末端與血管內(nèi)皮細胞生長 因 子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）的肝素區(qū)結(jié)合，進而抑制內(nèi)皮細胞增殖，影響血管收縮與舒張功能的調(diào)節(jié)。目前，國內(nèi)外關(guān)于ADAMTS－1與腦血管疾病的研究尚不多。Crossa等［12］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠大腦中動脈短暫閉塞后，星形膠質(zhì)細胞中ADAMTS－1mRNA表達升高；而且腫瘤壞死 因子－α（tumor necrosis factor－alpha ，TNF－α）等炎性反應介質(zhì)可上調(diào)ADAMTS－1在星形膠質(zhì)細胞中的表達，加速細胞外基質(zhì)的降解，促使神經(jīng)細胞從基膜脫落、凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，與sham組相比，SAH后6h大鼠基底動脈 ADAMTS－1mRNA含量及 ADAMTS－1蛋白表達無顯著差異；SAH后12h基底動脈ADAMTS－1mRNA含量及ADAMTS－1蛋白表達顯著升高，于24h達到高峰，48h開始下降，72h仍高于sham組水平。同時，與sham組比較，SAH后6h大鼠基底動脈形態(tài)無顯著變化；SAH后12h大鼠基底動脈管徑變小，管壁增厚，內(nèi)膜呈波浪狀改變；24h大鼠基底動脈痙攣最明顯，內(nèi)皮細胞部分脫落，內(nèi)膜明顯皺縮；48h大鼠基底動脈管腔較24h增大，管壁變薄，內(nèi)膜皺縮減輕；72h大鼠基底動脈管徑顯著增大，管壁進一步變薄，內(nèi)膜皺縮明顯減輕。SAH后早期大鼠基底動脈中ADAMTS－1的表達與急性CVS呈正相關(guān)，提示SAH后ADAMTS－1參與大鼠基底動脈早期急性CVS的發(fā)生，但其具體病理機制尚待進一步研究。

［1］ Baldwin ME，Macdonald R，Huo D，et al．Early vasospasm on admission angiography in patients with aneurismal subarachnoid hemorrhage is a predictor for in－h(huán)ospital complications and poor outcome ［J］．Stroke，2004，35（11）：2506－2511．

［2］ Luo C，Yi B，Chen Z，et al．PKGIαinhibits the proliferation of cerebral arterial smooth muscle cell induced by oxyhemoglobin after subarachnoid hemorrhage［J］．Acta Neurochir Suppl，2011，110（Pt1）：167－171．

［3］ Vatter H，Weidauer S，Dias S，et al．Persistence of the nitric oxide－dependent vasodilator pathway of cerebral vessels after experimental subarachnoid hemorrhage［J］．Neurosurgery，2007，60（1）：179－187；discussion187－188．

［4］ Muroi C，Mink S，Seule M，et al．Monitoring of the inflammatory response after aneurysmal subarachnoid haemorrhage in the clinical setting：review of literature and report of preliminary clinical experience［J］．Acta Neurochir Suppl，2011，110（Pt1）：191－196．

［5］ 陳開來，魯曉杰，張曉彪，等．顱內(nèi)動脈瘤出血患者腦脊液NO、NOS和ET含量的變化［J］．中國臨床醫(yī)學，2007，13（4）：561－563．

［6］ Cheng G，Wei L，Zhi－Dan S，et al．Atorvastatin ameliorates cerebral vasospasm and early brain injury after subarachnoid hemorrhage and inhibits caspase－dependent apoptosis pathway［J］．BMC Neurosci，2009，10（7）：1186－1197．

［7］ Haddock G，Cross AK，Plumb J，et al．Expression of ADAMTS－1，－4，－5and TIMP－3in normal and multiple sclerosis CNS white matter［J］．Mult Scler，2006，12（4）：386－396．

［8］ Ansar S，Svendgaard NA，Edvinsson L，et al．Neurokinin－1 receptor antagonism in a rat model of subarachnoid hemorrhage：prevention of upregulation of contractile ETB and 5－HT1Breceptors and cerebral blood flow reduction［J］．J Neurosurg，2007，106（5）：881－886．

［9］ Burgos－Ramos E，Puebla－Jiménez L，Arilla－Ferreiro E，et al．Minocycline provides protection against beta－amyloid（25－35）－induced alterations of the somatostatin signaling pathway in the rat temporal cortex［J］．Neuroscience，2008，154（4）：1458－1466．

［10］ Cahill WJ，Calvert JW，Zhang JH，et al．Mechanisms of early brain injury after subarachnoid hemorrhage［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2006，26（11）：1341－1353．

［11］ J?nsson－Rylander AC，Nilsson T，F(xiàn)ritsche－Danielson R，et al．Role of ADAMTS－1in athemsclemsis：remodeling of carotidartery，immunohistochemistry，and proteolysis of versican［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，259（1）：180－185．

［12］ Crossa AK，Haddocka G，Stockc CJ，et al．ADAMTS－1and－4are up－regulated following transient middle cerebral artery occlusion in the rat and their expression is modulated by TNF in cultured astrocytes［J］．Brain Res，2006，1088（1）：19－30．