王炳謙，姜再勝，戶 國，石存斌，王 芳，谷 偉，白慶利

（1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070；3.中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣州 510380）

傳染性造血器官壞死病毒（Infectious haemato?poietic necrosis virus，IHNV）屬于彈狀病毒科諾拉彈狀病毒屬（Novirhabdovirus），病毒粒子形態(tài)為彈狀，直徑80～90 nm，長度為160～180 nm，有囊膜，對熱、酸、乙醚不穩(wěn)定[1-2]。由該病毒引起傳染性造血器官壞死病是一種嚴重養(yǎng)殖鮭科魚類病毒性疾病，發(fā)病急、死亡率高。我國現(xiàn)階段虹鱒養(yǎng)殖模式大部分是作坊式個體養(yǎng)殖，不注重遺傳改良和親本種質遺傳維護，養(yǎng)殖環(huán)境比較惡劣，疾病防控意識和能力較差[3]。集約化高密度養(yǎng)殖導致環(huán)境脅迫，以及苗種引種管理方式不當，極易出現(xiàn)IHN疫病傳播[1]。近年來，遼寧本溪、河北淶源、甘肅永登、永昌等虹鱒主要養(yǎng)殖區(qū)域大面積爆發(fā)IHN疫病，給當?shù)睾琪V養(yǎng)殖業(yè)造成損失加強對鮭鱒魚傳染性造血器官壞死病防控尤為重要。

目前，國內外在疫苗制備和中草藥制劑等防控虹鱒IHN疾病暴發(fā)方法研究處于早期研制階段，通過遺傳改良手段提高虹鱒對IHN等病毒性疾病抗性成為防此類疾病主要途徑。

近年來，歐美及日本等國養(yǎng)殖鮭科魚類IHN爆發(fā)較少，上述地區(qū)主要爆發(fā)性病毒是傳染性胰臟壞死病毒（Infectious pancreatic necrosis virus，IPNV），相應地養(yǎng)殖鮭科魚類IPN抗病育種相關研究開展較多[3-5]。Okamoto等研究發(fā)現(xiàn)，IPN爆發(fā)后存活個體作為親本交配獲得后裔IPN抗病力顯著提高[6]。在大西洋鮭中，不同品系群體對IPN抗病能力存在很大差異，挪威Aqua Gen公司通過家系選擇提高大西洋鮭IPN抗病力，并在商業(yè)群體中得到應用[7]。上述研究表明，主要養(yǎng)殖鮭科魚類IPN抗病力可以通過遺傳選擇得到提高，進而可以獲得有商業(yè)價值抗病群體（品系）。虹鱒和大西洋鮭IPN抗病力開展抗病育種取得成功經(jīng)驗，提示我們采用選擇育種手段對虹鱒IHN抗病性能進行遺傳改良在技術上可行。

本研究采用虹鱒優(yōu)良品系G2世代作為基礎群體，在避免全同胞和半同胞交配基礎上，通過隨機交配組建60個全同胞家系，對上述家系進行IH?NV人工感染試驗，估計虹鱒對IHN抗病力方差組分，計算虹鱒IHN抗病力遺傳力，并嘗試對虹鱒IHN抗病家系進行篩選，以期為虹鱒抗傳染性造血器官壞死病新品種選育提供參考依據(jù)，為虹鱒抗病種質創(chuàng)新提供必要遺傳學材料。

1 材料與方法

1.1 動物

試驗用虹鱒來自于中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所以中國渤海品系（由朝鮮品系與日本品系群體混雜形成品系）、丹麥品系（來自丹麥一個品系）、挪威品系（來自挪威）、道氏品系（道氏優(yōu)質虹鱒）和加州品系（來自美國加州）等5個地理遠緣品系建立為基礎群體，利用家系選育結合動物模型BLUP多性狀復合育種選育獲得虹鱒優(yōu)良品系[8-10]。本試驗使用該品系G2世代性成熟親魚在避免全同胞和半同胞交配基礎上，隨機交配組建60個全同胞家系進行后續(xù)分析。將上述虹鱒全同胞家系受精卵平均分為兩份，其中一份用于后續(xù)IH?NV病毒感染試驗；另一份放置于專用育種孵化車間經(jīng)至60 mg·L-1聚維酮碘溶液浸浴消毒后阿特金式孵化器分家系孵化管理，根據(jù)試驗結果選留抗病性能優(yōu)良家系備存。每個家系可供攻毒試驗上浮稚魚個體在1 000～1 500尾。另外，隨機選擇三組共計1 500尾虹鱒稚魚作為對照組。

1.2 病原體檢測確認

1.2.1 病毒分離培養(yǎng)檢測

將收集用于攻毒試驗毒魚苗內臟組織勻漿后進行差速離心，取上清，0.22 um過濾除菌，1∶10稀釋后接種成致密單層鯉上皮瘤細胞（Epithelioma papulosum cyprini，EPC）株，15℃培養(yǎng)，用倒置顯微鏡觀察細胞表型變化。

1.2.2 RT-PCR及測序鑒定

為進一步確認毒魚苗出現(xiàn)癥狀由IHNV感染引起，又進行RT-PCR及測序分析。根據(jù)GenBank中已登陸IHNVN蛋白基因設計合成檢測引物，共合成3對，其中用于后續(xù)測序分析引物為NP3（見表1）。

表1 RT-PCR檢測所用引物序列Table 1 Primers used in the RT-PCR analyses

取5尾魚苗肝臟和腎臟等組織混合，Trizol試劑盒方法提取試驗魚內臟總RNA。根據(jù)TaKaRa RNA PCR kit Ver 3.0試劑盒說明書，以總RNA為模版，合成cDNA第一鏈；以cDNA第一鏈為模版進行G蛋白和N蛋白基因片段PCR擴增。PCR擴增條件均為：94℃預變性4 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個循環(huán)，最后延伸8 min。反應產(chǎn)物用用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離、回收、克隆和測序。與GenBank中已登陸IHNVN蛋白進行比對分析，做出判斷。

1.3 感染試驗

感染試驗在高精度可控溫封閉水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)內進行。該可控溫水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)規(guī)格為60 cm×50 cm×50 cm容積三個隔斷培養(yǎng)箱，每個隔斷中設置4個同等規(guī)格小型網(wǎng)箱。該系統(tǒng)中水質符合飼養(yǎng)虹鱒要求，水中溶解O2＞7.0 mg·L-1；pH為6.5～7.5；水中氨氮總含量＜5.0 mg·L-1。 配置有紫外消毒系統(tǒng)，溫度調控精度可達0.1℃。受精卵在網(wǎng)箱中采用循環(huán)水，在水溫12±0.2℃溫度下，避光孵化至上浮，飼養(yǎng)管理按智利三福（SalmonFood）公司生產(chǎn)VitaCare飼料投喂說明執(zhí)行。本研究中人工感染試驗采用浸浴方式，利用收集帶毒苗種處理水體，橫向傳播病毒。為確認試驗平行性與重復性開食之前隨機選取3個家系以及隨機選取3組常規(guī)商業(yè)養(yǎng)殖道氏隨機群體，每個家系隨機均分成3份，任意放置在3個不同水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)小網(wǎng)箱中對初浮稚魚進行感染試驗，對照組每組放入隨機小網(wǎng)箱中，此時苗種規(guī)格為0.15～0.2 g。其他每個受試家系受試個體全部轉入前述一個獨立小型網(wǎng)箱中，攻毒約15日后大量初浮稚魚出現(xiàn)疑似IHN發(fā)病癥狀后轉入流水養(yǎng)殖條件，飼養(yǎng)在相同規(guī)格圓柱形選育缸中，水質符合虹鱒養(yǎng)殖要求，尾排水經(jīng)無害化處理后排放。上浮90日齡時統(tǒng)計累計死亡率后將所有受試虹鱒苗種銷毀。

1.4 IHN抗病力遺傳參數(shù)估計

本研究中定義IHN抗病力為二元閾性狀。閾性狀度量一般用有限幾個性狀相對發(fā)生率表示，這種非連續(xù)多個表現(xiàn)狀態(tài)分布具有一個潛在連續(xù)分布。在一個兩狀態(tài)閾性狀分布情況下，其連續(xù)分布上有一取值，稱為閾值（Threshold value），它把群體分為兩類，各取一種狀態(tài)。對個體而言，每個個體只能取閾性狀中一種狀態(tài)，而在一個群體中卻可以取任一狀態(tài)。本研究遺傳參數(shù)估計擬采用貝葉斯動物閾模型處理，該方法基于閾模型和貝葉斯理論，根據(jù)貝葉斯理論可知，以第j個全同胞家系中第i個動物個體表型觀察值yij為條件聯(lián)合后驗密度為：

在標準閾模型中，個體觀察值yij通常被假定由潛連續(xù)分布ηij決定，則有

根據(jù)本研究實際情況，構建動物模型如下：

其中yij是第j個全同胞家系中第i個動物個體表型觀察值；ai是第i個動物個體隨機加性效應；tj是第j個家系（由于每個家系都分別處于一個單元中，也是第j個單元）共同環(huán)境效應；eij是每個個體隨機殘差。動物個體效應假定為a～N(0,Aσ2a)；全同胞效應假定為t～N(0,Iσ2t)；閾模型中隨機殘差方差固定為1。t效應中除包含共同環(huán)境效應，還包含有全同胞效應、母體效應以及非加性效應等無法單獨剖分效應。

于是，對于本研究中定義虹鱒IHNV抗性這一性狀狹義遺傳力（h2）可以這樣求解：

公式中σ2a是群體加性方差估計值；σ2t是由每個家系處于單獨網(wǎng)箱中所產(chǎn)生方差估計值；σ2e是剩余方差估計值，在閾模型中固定為1。本研究中通過吉布斯抽樣（Gibbs sampling）方法求解貝葉斯閾模型方法來獲得相關方差組分，進而求得遺傳力。統(tǒng)計分析工具為DMU軟件包中rjmc組件[11]，吉布斯抽樣過程共進行10 000次迭代，其中初始階段1 000次迭代結果被舍棄，其余9 000次迭代結果用于估計隨機效應邊際分布均值。

1.5 IHN抗病家系篩選

在只考慮單一性狀條件下，根據(jù)閾性狀特點，在每個家系受試個體數(shù)量較大時候，不必求解閾性狀育種值，只需根據(jù)家系感染后存活率這一表型值直接進行選擇即可。因此，本研究以上浮90日累積死亡率（90日累積死亡個體數(shù)/家系個體總數(shù)×100%）和存活率（存活個體數(shù)/家系個體總數(shù)×100%；也即1-累積死亡率）為考察指標來評價各個家系對IHNV病毒抗病能力，據(jù)此排序進行抗病家系篩選。

2 結果與分析

2.1 病原體檢測確認

用倒置顯微鏡檢測，接種病魚上清液EPC細胞，以及再傳代EPC細胞，均出現(xiàn)類似細胞病變情況，初步認為用于攻毒試驗病料魚苗感染IHNV病毒。然后提取病料組織勻漿進行RT-PCR及測序鑒定病原體。RT-PCR擴增結果顯示，試驗魚擴增IHNV病毒PCR擴增結果都呈陽性且片段大小與預期一致。對引物NP3擴增產(chǎn)物序列進行回收測序，序列結果如下（RT-PCR應設立陰性和陽性對照組）。

CCTCCTGTGCGCGTTCGTCATTGCGGAGACGGTCC CATCGGGGACAGGCACGGTCGCCGAAACTCTGGA AGCCCTGGGCTTCTTGCTGGAGTCTTTGGACACTG GGGCACCACTGGACGCCACTTTCGCAGATCCCAA CAACAAGCTTGCAGAAACGATCGGAAAGGAAAAT GTCCTTGAGGTTGTGACCGGCCTCCTCTTCACCTG CGCTCTACTGACGAAGTATGACGTGGACAAGATG GCCATATACTGCCAAAACAAGCTCGAGCGTCTTGC AACCAGCCAAGGGATTGACGAGTTGGTCAACTTC AACTCCAACAGGGGAGTGCTGGCCAAGATCGGGG CGGTACTTAGACCTGGACAGAAGCTCACCAAGGC TATTTATGGGATCATTCTCATCAACCTGTCTGACC CAGCCACCGCCGCTAGAGCCAAGGCACTGTGCGC CATGAGACTGAGCGGGACAGGGATGACAATGGTG GGACTGTTCAACCAAGCCGCAAAGAACCTGGGCG CCCTTCCAGCAGACCTTCTAGAAGATCTGTGCATG AAGTCAGTGGTGGAGTCCGCCAGACGCATTGTCA（下劃線標記部分是引物序列）。

BLAST比對結果顯示，該序列與傳染性造血器官壞死病病毒zyx N蛋白基因[Infectious hemato?poietic necrosis virus strain zyx nucleoprotein（N）gene（HM099906）]一致性（identity）最高，達99%；與其他已登錄傳染性造血器官壞死病病毒N蛋白基因具有較高一致性，在94%以上。根據(jù)病毒分離結果和PCR檢測結果，可確定虹鱒魚苗確實攜帶有傳染性造血器官壞死病病毒（IHNV）。

2.2 試驗重復性與平行性

3組對照道氏虹鱒死亡率介于90%～100%，證實常規(guī)商業(yè)養(yǎng)殖群體對IHNV抗性較低，由于該對照組為常規(guī)商業(yè)養(yǎng)殖群體，沒有系譜記錄信息，下一步遺傳分析并不涉及對照組數(shù)據(jù)。3組家系每個家系隨機在3個不同小網(wǎng)箱感染試驗測試結果顯示本研究中感染試驗有很好平行性和重復性，具體結果見表2。

表2 3個重復家系存活率每個家系3次平行試驗結果Table 2 Survival rate in three replicated families each family with three replicates （%）

2.3 虹鱒IHNV抗性遺傳參數(shù)估計

表3中計算虹鱒IHN抗病力各個可以剖分方差組分估計值和標準誤差，據(jù)此根據(jù)公式（5）可以計算求得該性狀狹義遺傳力約為0.34。

表3 虹鱒IHNV抗性方差組分剖分Table 3 Variance components of resistance to IHN in rainbow trout

2.4 抗病家系篩選

本研究計算所有60個全同胞家系IHNV感染至上浮90日期間累積死亡率和存活率。結果顯示各家系累計存活率變化范圍在0%～90.1%之間，有多達50個家系上浮90日累計死亡率超過90%，即存活率小于10%，存活率在20～50%家系有2個，存活率超過50%家系有8個，其中有1個家系（編號為K23）存活率超過90%（見圖1）。結果表明，不同家系IHNV感染后存活率之間確實存在著較大遺傳變異，存在著非常大遺傳選擇潛力。

圖1 IHNV感染后存活率超過10%10個虹鱒家系Fig.1 The survival rate of the 10 rainbow trout families greater than 10%after IHNV infection

3 討論與結論

本研究中定義IHN抗病力性狀，類似于人類疾病，是一個非連續(xù)二元變量，只有疾病受累和非受累兩個狀態(tài)，在本研究中表征生存或死亡，其分布具有一個潛在連續(xù)分布性狀，這個潛在連續(xù)性狀通常被定義為疾病易感性性狀（liability trait）[12]。對于疾病易感性遺傳分析可以采用如下遺傳模型，如測試期間生存模型（Test period survival），測定日生存模型（Test-day survival）以及測試期間累計死亡數(shù)據(jù)歸并模型（Time until death taking censoring into account）等；相應地可以采用廣義線性模型、閾模型、Cox&Weibull比例失效率模型等統(tǒng)計模型求解[13-15]。本研究采用?deg?rd等提出貝葉斯動物閾模型，該模型對遺傳參數(shù)估計數(shù)值較為精確，適合于本研究中IHN抗病力遺傳分析[16]。

免疫學研究結果顯示，鮭科魚類免疫系統(tǒng)與其他魚類差異不大，感染病毒后病魚恢復期抗原可使接種魚類獲得部分或全部免疫保護作用，對病毒免疫持續(xù)時間可達一年以上。這意味鮭科魚類感染病毒后可獲得有效抗體，親本有可能通過配子將抗體直接傳遞給子代，即對病毒性疾病抵抗力極可能是可遺傳[17]。遺傳學研究也獲得類似結果，Mclntyre和Amend研究紅大馬哈（Onchoryn?chus nerka）對IHN抗病力遺傳力，對45個全同胞家系后代進行三次獨立試驗，結果表明，紅大馬哈孵化后30、60、90日IHN抗性遺傳力分別為0.31，0.27和0.38[18]。Yamamoto等對虹鱒IHN抗病力遺傳力進行估計，虹鱒對高濃度IHNV病毒抗性父系遺傳力為0.51，母系遺傳力為0.66[19]。本研究中虹鱒IHN抗病力遺傳力約為0.34，低于Yamamo?to等獲得結果。產(chǎn)生這個差異原因是多方面，首先是本研究采用攻毒方法沒有對病毒在水體中濃度進行定量，不能嚴格與Yamamoto等[19]結果比較；另外，本研究采用貝葉斯閾模型求解相關遺傳參數(shù)，而Yamamoto等采用統(tǒng)計模型為傳統(tǒng)同胞估計，其中還有很多方差組分沒有得到很好剖分，同胞估計方法獲得遺傳力通常要高于該性狀遺傳力實際值[19]。本研究和上述其他研究中關于IHN抗病力遺傳參數(shù)估計結果都顯示，鮭魚IHN抗病力遺傳力具有中等或中等以上遺傳力，即虹鱒對IHN抵抗力性狀是可以穩(wěn)定遺傳并可以通過選擇育種手段獲得改良。

研究表明不同遺傳模型分析獲得閾性狀遺傳參數(shù)盡管數(shù)值有所不同，但是所有模型求解育種值都與家系累計存活率排序存在高度秩相關[13-15]。虹鱒IHN抗病力育種值與家系存活率排序也是高度秩相關。因此，本研究在獲得虹鱒IHN抗病力遺傳力基礎上，未計算該性狀育種值，只是直接進行基于表型家系選擇。本研究中采用試驗群體在農業(yè)部冷水性魚類遺傳育種中心處于規(guī)范健康養(yǎng)殖環(huán)境中，之前從未接觸過IHNV病毒，在IH?NV感染后，大部分家系存活率都小于10%。但是在這種情況下，本研究仍然發(fā)現(xiàn)一些高存活率家系，有K23、K36等兩個家系存活率分別達到90.1%和79.9%。根據(jù)抗病性狀特點，死亡個體不能參與繁殖后代，并不能將其遺傳性能真實地遺傳到下一世代群體；而同一全同胞家系內存活個體由于父母本都相同，表型值也相同，所以在育種值上表現(xiàn)為同一家系內所有存活個體抗病育種值在數(shù)值相等。這個性質使這類性狀易納入到多性狀復合育種技術育種指數(shù)中，中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所在中國對蝦、牙鲆、半滑舌鰨等重要海水養(yǎng)殖對象已經(jīng)開展抗病與生長性狀多性狀復合育種研究，并取得良好選育效果[20-22]。本研究也考慮將這一性狀納入到虹鱒良種選育整體育種規(guī)劃中。

已有研究結果表明，IHNV致病力與病原發(fā)病季節(jié)等時間因素關系不大，但是與病毒采集地點存在密切相關[1]。本研究未采用標準毒株進行感染試驗，而是收集當年發(fā)病地區(qū)病原進行攻毒試驗。是因為期望在相對較短時間周期內獲得能夠抵抗目前正對國內虹鱒養(yǎng)殖業(yè)造成危害IHNV株型種質材料。另外，通過堿性磷酸酶免疫組織化學法研究結果表明，IHNV感染一般有兩個途徑：一是由鰓進入循環(huán)系統(tǒng)；二是由口進入消化道[1]。IH?NV可以通過水體進入虹鱒循環(huán)系統(tǒng)，而一旦進入循環(huán)系統(tǒng)，就可擴散至全身。由于目前國內虹鱒養(yǎng)殖過程中從苗種到商品魚各個規(guī)格虹鱒大部分都采用全價配合顆粒飼料，在包裝開封之前幾乎不存在被病毒污染可能性。據(jù)此本研究推測國內養(yǎng)殖環(huán)境中IHNV感染途徑主要是病毒通過水體進入魚體循環(huán)系統(tǒng)繼而感染全身。因此，本研究中采用浸浴方法進行感染試驗，以期可以最大限度地模擬在中國養(yǎng)殖環(huán)境下虹鱒感染IHNV病毒主要途徑。

限于試驗設施、試驗條件及試驗操作方便程度等因素，本研究中對攻毒試驗平行性和重復性進行最小可接受3×3試驗設計，即采用任意3個家系分別進行3次重復試驗，試驗結果顯示本試驗具有良好重復性和平行性。由于這個重復和平行試驗測試只是對本研究中60個家系中很少一部分樣本進行測試，并不能完全代表整個試驗平行性和重復性水平，待試驗設施和試驗條件完備后，需要進一步擴大重復試驗和平行試驗規(guī)模，并進行多點測試，以期獲得更為可靠和穩(wěn)定結果。

本研究開展虹鱒傳染性造血器官壞死?。↖HN）抗病力遺傳參數(shù)估計并初步進行IHN抗病家系篩選工作，獲得8個存活率超過50%抗病性能優(yōu)良家系，其中有1個家系（編號為K23）存活率超過90%，是極具潛力開展虹鱒抗IHN疾病育種遺傳材料，從免疫生理、免疫遺傳及分子遺傳等方面開展進一步深入研究。本研究結果對虹鱒抗傳染性造血器官壞死病新品種選育及抗病虹鱒生產(chǎn)推廣制種繁育技術體系建立具有參考價值。

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