應(yīng)國紅，王曉沖，李 軍，王曉煒*，周繼昌

（1.深圳藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳市藥品檢驗(yàn)所，廣東 深圳 518000；2.深圳市慢性病防治中心，廣東 深圳 518000）

注射用藥品、生物制品中細(xì)菌污染可致患者出現(xiàn)熱原反應(yīng)，嚴(yán)重會引起膿毒血癥、敗血癥、內(nèi)毒素中毒甚至死亡。隨著分子生物學(xué)發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者將實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)（RTPCR）引入微生物檢測中，縮短檢測時間，提高靈敏度[1-2]。然而，此法缺點(diǎn)是不能區(qū)分所檢測到細(xì)菌是活細(xì)胞還是死細(xì)胞，樣品中死菌及基因組會產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致假陽性結(jié)果，造成實(shí)際應(yīng)用困難。

疊氮溴化丙錠（PMA）是一類對DNA具有高度親和力光敏DNA染料，經(jīng)PMA前處理后樣品暴露于強(qiáng)光下時，PMA與DNA分子共價(jià)結(jié)合，阻斷DNA分子PCR擴(kuò)增[3]。利用PMA特性，將PMA與實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)相結(jié)合，能夠選擇性抑制藥品中死菌DNA擴(kuò)增，有效避免假陽性結(jié)果。目前，關(guān)于PMA與RT-PCR相結(jié)合檢測活菌報(bào)道很少，多集中于某種單一致病菌[4-5]，在實(shí)際應(yīng)用中，樣品中可能含有不同種類死菌，不同種類微生物因其細(xì)胞膜及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)差異，最適宜PMA濃度不同，本研究將PMA與RT-PCR相結(jié)合，以金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌分別做為革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌為考查對象，在證實(shí)PMA區(qū)分死菌/活菌能力基礎(chǔ)上，研究PMA可同時抑制革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌死菌DNA PCR擴(kuò)增最佳濃度、曝光時間，從而建立一種快速、有效區(qū)分藥品中死/活細(xì)菌方法，應(yīng)用于藥品中污染細(xì)菌PCR檢測。

1 材料與方法

1.1 菌株

金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003-5a9，大腸埃希菌CMCC（B）44102-3a8，均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 試劑與儀器

細(xì)菌裂解試劑盒（購自TAKARA大連寶生物公司）；PMA（規(guī)格：1 mg，純度＞99%，購自美國Sigma公司）；Taqman熒光定量PCR試劑（購自TA?KARA大連寶生物公司）；LightCycler?480型實(shí)時熒光定量PCR儀（購自德國Roche Diagnostics公司）；電泳儀（購自美國Bio-Rad公司）；3K15型超速冷凍離心機(jī)（購自德國SIGMA公司）；500W鹵鎢燈（購自佛山電器照明股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 活菌和死菌懸液制備

分別挑取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌單菌落接種于10 mL營養(yǎng)肉湯中37℃，培養(yǎng)16 h，高速離心（8 000 r·min-1，4℃，5 min）收集菌體沉淀，經(jīng)0.85%滅菌生理鹽水洗滌2次后，重懸于生理鹽水中。取定量菌懸液梯度稀釋，測定每個梯度OD600mm并涂布營養(yǎng)瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)48 h后測定活菌數(shù)，以活菌數(shù)（x軸）和OD600mm值（y軸）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，在本試驗(yàn)中，以此標(biāo)準(zhǔn)曲線調(diào)整菌液濃度。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次重復(fù)3次。

取上述經(jīng)洗滌大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌菌懸液，調(diào)整濃度至4×107cfu·mL-1制成活菌懸液，再取部分活菌懸液95℃水浴10 min，制成死菌懸液。另外，將死菌懸液在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，于37℃培養(yǎng)48 h，以驗(yàn)證滅活效果。

1.3.2 樣品PMA處理方法

PMA溶解于二甲亞砜中，配制成0.5 mg·mL-1PMA母液（-20℃避光保存）。在樣品中加入所需濃度PMA，室溫避光處理10 min，然后將離心管開蓋放置冰上，在距離鹵素?zé)艄?6 cm處曝光5 min。曝光后混合菌懸液12 000 r·min-1離心5 min，收集菌體，倒掉上清液，再次重懸于100 μL生理鹽水中（未加入細(xì)菌生理鹽水0.5 mL作為陰性對照），應(yīng)用裂解試劑盒（Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR）提取DNA。抽提步驟：12 000 r·min-1，離心10 min，小心吸棄上清，加入50 μL裂解液，吹打均勻，80℃熱變性15 min后，低速離心1 min，取5 μL裂解后上清液作為PCR反應(yīng)模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。

1.3.3 抑制死菌RT-PCR反應(yīng)最小PMA濃度確定

在0.5 mL大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌死菌懸液（4×107cfu·mL-1）離心管中加入一定量PMA母液（0.5 mg·mL-1），使其終濃度分別為 0.0、0.2、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0 μg·mL-1，另取一只離心管加入0.5 mL滅菌生理鹽水，不加PMA作為陰性對照，再按2.2方法進(jìn)行樣品處理，考察抑制死菌RT-PCR反應(yīng)最小PMA濃度。

1.3.4 不抑制活菌RT-PCR反應(yīng)最大PMA濃度確定

在含有0.5 mL大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌活菌懸液（4×107cfu·mL-1）離心管中加入一定量PMA 母液（0.5 mg·mL-1），使其終濃度分別為0.0、1.0、3.0、5.0、10.0、20.0 和 40.0 μg·mL-1，再按2.2方法進(jìn)行樣品處理，考察不抑制活菌RT-PCR反應(yīng)最大PMA濃度。

1.3.5 最佳PMA交聯(lián)曝光時間確定

在0.5 mL大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌死菌懸液（4×107cfu·mL-1）離心管中加入一定量PMA母液（0.5 mg·mL-1），使其終濃度為 5 μg·mL-1，用500 W鹵素?zé)粢云毓鈺r間0、1、2、3、4、5、10、20 min進(jìn)行PMA交聯(lián)，獲取適宜PMA交聯(lián)曝光時間。

1.3.6 死/活細(xì)胞混合菌懸液PMA RT-PCR擴(kuò)增

取完全相同2組離心管，分別加入0.25 mL固定數(shù)量（2×107cfu·mL-1）金黃色葡萄球菌死菌懸液與0.25 mL變化數(shù)量（2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2 ×102、2× 101和0 cfu·mL-1）金黃色葡萄球菌活菌懸液，混合均勻。一組加入0.5 mg·mL-1PMA，使PMA終濃度達(dá)到5 μg·mL-1，按2.2方法進(jìn)行樣品處理，進(jìn)行PMA RT-PCR；一組不加PMA直接提取基因組DNA進(jìn)行常規(guī)RT-PCR。另取1組離心管，分別加入0.25 mL去離子水與0.25 mL 變化數(shù)量（2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2 ×102、2× 101和0 cfu·mL-1）金黃色葡萄球菌活菌懸液，混合均勻，提取基因組DNA，進(jìn)行RT-PCR作為對照。

1.3.7 引物及RT-PCR擴(kuò)增

試驗(yàn)采用實(shí)時熒光定量PCR儀，利用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物[6-7]，上游引物：5'TCC TACGGGAGGCAGCAGT 3'，下游引物：5'GGAC?TACCAGGGTATCTAATCCT 3'，探針：FAM-5'CG?TATTACCGCGGCTGCTGGCAC 3'-TAMRA。PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系25 μL，引物和探針（由英濰捷基合成）終濃度為0.2 μmol·L-1，dNTP終濃度為200 μmol·L-1，Mg2+終濃度 2.5 mmol·L-1，Hot Ex TaqHS 0.05 U，然后加入5 μL DNA模版。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性（95℃，30 s）；擴(kuò)增（95℃ 5 s，60℃1 min，40 cycles）。每個RT-PCR反應(yīng)重復(fù)3次，得到平均Ct值和標(biāo)準(zhǔn)背離值。所得數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05表示具有差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR檢測體系中PMA濃度優(yōu)化

由表1可知，當(dāng)PCR反應(yīng)體系中PMA濃度≤1 μg·mL-1時，PMA對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌死菌DNAPCR擴(kuò)增沒有顯著影響，而當(dāng)PMA濃度達(dá)到3.0 μg·mL-1時，大腸埃希菌Ct值與PMA終濃度0.0 μg·mL-1比差異顯著（P＜0.05），證明PMA能有效抑制大腸埃希菌死菌DNAPCR擴(kuò)增；當(dāng)PMA濃度達(dá)到5.0 μg·mL-1時，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌Ct值與PMA終濃度0.0 μg·mL-1比均差異顯著（P＜0.05），證明PMA能同時有效抑制大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌死菌DNAPCR擴(kuò)增，在該濃度下，RT-PCRCt值與陰性對照相差不大，無顯著差異（P＞0.05），說明樣品中死菌DNAPCR擴(kuò)增被完全抑制。當(dāng)繼續(xù)增加PMA濃度時，其抑制效果沒有明顯提高，因此，能同時抑制大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌死菌DNA PCR反應(yīng)最小PMA濃度為 5.0 μg·mL-1。當(dāng)PMA濃度小于20 μg·mL-1時，對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌活菌PCR擴(kuò)增影響較小，這與報(bào)道同類物質(zhì)EMA不抑制活菌PCR反應(yīng)最大濃度5和3 μg·mL-1差別較大[4-5]，這是由于EMA對活細(xì)胞有毒性，具有較高細(xì)胞膜透性，能穿過細(xì)菌活細(xì)胞完整細(xì)胞膜與DNA交聯(lián)[3,8]，使其應(yīng)用受到較大限制。

表1 PMA使用濃度優(yōu)化Table 1 Optimization of PMA concentration

2.2 PMA處理最佳曝光時間

光照時間對活菌檢測準(zhǔn)確率具有重要影響，光照時間不足，PMA不能完全分解，在后續(xù)提取過程中會與裂解活菌DNA分子結(jié)合，使PCR反應(yīng)受到影響。熱致死大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌菌懸液（4×107cfu·mL-1）分別經(jīng)PMA（終濃度 5 μg·mL-1）處理后，曝光1～20 min，結(jié)果如圖1所示。曝光時間超過5 min后，PMA對RT-PCR Ct值影響隨時間增加變化不明顯，說明光照5 min，可使加入PMA分子全部分解。

圖1 曝光時間對PMA處理死細(xì)胞影響Fig.1 Effect of light exposure time on PMA treatment of dead cells

2.3 PMA RT-PCR對活菌/死菌混合物檢測

如圖2所示，常規(guī)RT-PCR反應(yīng)由于無法區(qū)分死活菌，混合體系中DNA含量相對固定，因此其Ct值變化不大；經(jīng)過PMA處理混合液，PMA與死菌基因組DNA共價(jià)結(jié)合，阻止這部分基因組DNA擴(kuò)增，PCR反應(yīng)Ct值與活菌對照接近，證明PMA能特異性地抑制混合體系中死菌擴(kuò)增，而對活菌擴(kuò)增幾乎沒有影響。

圖2 PMA RT-PCR對不同比例活細(xì)胞/死細(xì)胞混合樣品檢測Fig.2 Detection for mixed bacteria by PMA RT-PCR

3 討論與結(jié)論

PMA能滲透到細(xì)胞壁或細(xì)胞膜不完整死細(xì)胞內(nèi)與基因組DNA共價(jià)結(jié)合，阻止其DNA PCR擴(kuò)增；而活細(xì)胞完整細(xì)胞壁、活細(xì)胞膜能夠阻止PMA滲透到菌體內(nèi)與DNA共價(jià)結(jié)合，因而其PCR擴(kuò)增不受影響。PMA這種性質(zhì)為PCR檢測區(qū)分樣品中死活菌提供可靠依據(jù)[3,8]。目前，PMA與PCR、Real-time PCR等技術(shù)結(jié)合，已經(jīng)被用于副溶血弧菌、軍團(tuán)桿菌、沙門氏菌等病原菌檢測[9-12]，來減少樣品中死菌干擾，避免假陽性結(jié)果。

本研究PMA對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌死菌抑制作用，發(fā)現(xiàn)在樣品前處理過程中加入終濃度為5 μg·mL-1PMA，能有效抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌死細(xì)（4×107cfu·mL-1）擴(kuò)增；而當(dāng)PMA濃度小于或等于20 μg·mL-1時，對活菌PCR擴(kuò)增沒有顯著影響。另外，在金黃色葡萄球菌活菌/死菌混合體系中，由于在活菌/死菌比例不同混合組中，DNA含量相對變化不大。因此，常規(guī)RT-PCR反應(yīng)Ct值變化不大；而加入PMA預(yù)處理后，RT-PCR反應(yīng)Ct值與每個PCR反應(yīng)體系中所存在活菌數(shù)對數(shù)值呈現(xiàn)線性關(guān)系，證明PMA能特異性地抑制混合體系中死菌擴(kuò)增。

應(yīng)用本研究建立的PMA前處理方法，能抑制革蘭氏陽性及陰性菌PCR過程中死菌DNA擴(kuò)增，彌補(bǔ)常規(guī)PCR無法區(qū)分樣品中活菌/死菌這一技術(shù)不足，降低PCR檢測過程中由于死菌造成假陽性結(jié)果風(fēng)險(xiǎn)，對于可能混有多種細(xì)菌污染藥品PCR檢測，具有很好應(yīng)用前景。

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