武彩霞，高學(xué)軍，李慶章，駱超超，畢微微，史琳琳，張 莉

（1.河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心，河北 張家口 075000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

益生菌發(fā)酵飼料集益生菌功效與優(yōu)質(zhì)飼料優(yōu)點，在畜禽生產(chǎn)中具有廣闊應(yīng)用前景[1]?？莶菅挎邨U菌作為發(fā)酵飼料益生菌之一，已廣泛用于生產(chǎn)，具有增進畜禽生長性能和較強抗性等優(yōu)點，在飼料制粒、儲存及在胃腸道中作用穩(wěn)定并保持較高活性[2]。賴氨酸是人類和動物營養(yǎng)所必需限制性氨基酸，在動物體內(nèi)會影響其他氨基酸利用率。利用基因工程方法已經(jīng)成功地將富含賴氨酸基因[3]和富含蛋氨酸基因[4]分別單獨轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中，并通過發(fā)酵枯草芽孢桿菌提高發(fā)酵飼料中賴氨酸和蛋氨酸含量，本文旨在研究將另外一種高賴氨酸基因（cflr）轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中，以提高枯草芽孢桿菌中賴氨酸含量，并提高發(fā)酵飼料中賴氨酸含量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

辣椒花藥（采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)香坊實驗實習(xí)基地）；野生型枯草芽孢桿菌168（B.subtilis168）（ATCC27370）為本實驗室保存；E.coliTOP10和pMD18-T載體，購自大連寶生物科技有限公司；枯草芽胞桿菌表達載體pHT43購自Axygen公司。

1.1.2 藥品

Trizol試劑購自Invitrogen公司；PrimeScript RT-PCR Kit、SYBR?Premix Ex Taq? Ⅱ（Perfect Real Time)、ExTaq酶、T4DNA連接酶、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶以及蛋白Marker，購自大連寶生物科技有限公司；氨芐青霉素、氯霉素、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）購自上海生工生物工程公司；L-賴氨酸標準品和1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）購自SIGMA公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司；EA?SYspin細菌RNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技公司；引物由北京英俊公司合成；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 辣椒花藥總RNA提取

采用Trizol法提取總RNA，cDNA合成采用試劑盒方法（見寶生物PrimeScript RT-PCR Kit說明書）。

1.2.2 高賴氨酸基因CflrPCR擴增

根據(jù)文獻[5]和NCBI上報道CflrcDNA全序列（基因登錄號：EU367999），設(shè)計Cflr引物，分別在上游引物和下游引物5端添加XbaⅠ和SmaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點（下劃線表示）。

上游引物為：5'GCTCTAGAAAAAGATGGGTT GTGGGGAAT 3'（XbaⅠ）

下游引物為：5'TCCCCCGGGTAAACTAATA?AATAGCCCTCTTCCC 3'（SmaⅠ）

以辣椒花藥cDNA為模板，進行CflrPCR擴增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性1 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸3 min，30個循環(huán)；72℃總延伸10 min；4℃保溫。取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。按Axygen凝膠回收試劑盒說明操作，對PCR產(chǎn)物進行回收純化。

1.2.3Cflr基因克隆和序列測定

將Cflr基因PCR擴增產(chǎn)物與pMD18-T載體進行連接，將其轉(zhuǎn)化于大腸桿菌TOP10感受態(tài)中，經(jīng)氨芐篩選后，挑取單菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，通過質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定，篩選出陽性克隆子，然后將陽性克隆子進行核酸序列測定（由北京英俊公司完成），測序結(jié)束后，用生物信息學(xué)軟件將所得測序序列和NCBI發(fā)布序列進行比對分析。

1.2.4 枯草芽胞桿菌中重組表達質(zhì)粒pHT43/Cflr構(gòu)建以及轉(zhuǎn)化

用XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切Cflr基因PCR擴增片段并進行膠回收，然后用T4連接酶與同樣雙酶切后膠回收pHT43連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pHT43/Cflr。通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Bacillus sub?tilis168中[6]。LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，氯霉素篩選。

1.2.5 枯草芽孢桿菌中含有重組質(zhì)粒鑒定

挑取單菌落于5 mL LB（含氯霉素）培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒[7]，用XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切鑒定，篩選陽性克隆子。

1.2.6 枯草芽孢桿菌中重組質(zhì)粒pHT43/Cflr在mRNA水平表達

將含有重組表達質(zhì)粒枯草芽孢桿菌在含有氯霉素LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD值為0.5～1.0時，加入1.0 mmol·L-1IPTG，取誘導(dǎo)0、2、12和24 h后菌體，用EASYspin細菌RNA快速提取試劑盒提取細菌總RNA，用于RT-PCR。

使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，采用SYBR染料法檢測不同誘導(dǎo)時間后Cflr基因在mRNA水平表達情況，以B.subtilis16816S rRNA為內(nèi)參，檢測Cflr基因表達情況。反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR程序參照說明書進行。引物設(shè)計為：16S rRNA F：GCGTGAGTGATGAAGGTTT，16S rRNA R：GCCGTGGCTTTCTGGTTA；CflrF：GAAAGAA ATGGTGGGAC，CflrR：CTACAGCAGCAACAGC。

1.2.7 枯草芽孢桿菌中重組質(zhì)粒pHT43/Cflr在蛋白水平表達

將含有重組表達質(zhì)?？莶菅挎邨U菌在含有氯霉素LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD值為0.5～1.0時，加入1.0 mmol·L-1IPTG，誘導(dǎo)24 h后，制取蛋白樣，然后進行SDS-PAGE電泳，其濃縮膠濃度為5%，電泳電壓為80 V，分離膠濃度為12%，電壓為120 V。電泳結(jié)束后，用固定液固定蛋白膠45 min，用考馬斯亮藍進行染色，經(jīng)脫色液脫色后觀察表達后產(chǎn)物條帶。

1.2.8 HPLC檢測菌液中l(wèi)ys含量

測定菌液中表達蛋白所含lys含量，取經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)24 h野生菌和重組菌菌液8 mL，按照GB/T 18246-2000[8]中酸水解法進行水解后，定容至50 mL。吸取1 mL濾液，分別置于50 mL離心管中，再分別吸取Na2CO3-NaHCO3pH 9.0緩沖液2 mL，混勻后，加入CDNB溶液各1 mL，混勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，取10 μL直接上樣測定其中l(wèi)ys含量，試驗重復(fù)5次，取平均值。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理，P＜0.05和P＜0.01表示差異顯著和極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cflr基因序列獲得

擴增出Cflr片段如圖1所示，在720 bp處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期大小相符，測序片段全長669 bp，將測序結(jié)果與NCBI上報道CflrcDNA全序列基因（基因登錄號：EU367999）進行同源性比對分析，結(jié)果同源性為99%。測序片段全長669 bp與NCBI報道序列比對，同源性達到99%。

圖1 Cflr基因PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 PCR products ofCflrgene

2.2 枯草芽胞桿菌中重組表達載體構(gòu)建和鑒定

重組質(zhì)粒pHT43/Cflr，如圖2所示，片段長為8 777 bp。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到枯草芽胞桿菌中，提取陽性克隆子，進行雙酶切鑒定，見圖3，在720 bp處出現(xiàn)目條帶，條帶大小符合預(yù)測值，證明重組表達載體質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入到枯草芽胞桿菌中。pHT43載體片段長度為8 057 bp。

圖2 枯草芽胞桿菌重組表達載體圖譜Fig.2 Map of recombinant expression vector

圖3 重組質(zhì)粒pHT43/Cflr鑒定圖譜Fig.3 Identification of the recombinant plasmid pHT43/Cflr

2.3 RT-PCR結(jié)果

RT-PCR結(jié)果顯示，在IPTG誘導(dǎo)以后，Cflr基因在mRNA水平表達，見圖4。由圖4可知，Cflr基因在2、12 h時，mRNA水平與與未誘導(dǎo)前相比均表現(xiàn)為顯著差異，24 h時，可檢測到Cflr基因mRNA，但水平與未誘導(dǎo)前相比并未表現(xiàn)為顯著差異；同時也證明Cflr基因已成功轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中并表達。

2.4 SDS-PAGE結(jié)果

將正?？莶菅挎邨U菌、含空載體pHT43重組菌和含重組質(zhì)粒重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后終止，離心取菌體進行SDS-PAGE，如圖5所示，與對照組相比，在試驗組中出現(xiàn)明顯目的蛋白條帶（目的蛋白大小是24 ku），表明cflr基因在枯草芽孢桿菌中已成功表達。

2.5 HPLC測菌發(fā)酵液中Lys含量

圖4 cflr基因表達結(jié)果Fig.4 Expression of cflr gene

圖5 蛋白電泳檢驗枯草芽胞桿菌中目蛋白Fig.5 SDS-PAGE detection of expression cflr in Bacillus subtilis

圖6 HPLC測定菌發(fā)酵液中Lys含量Fig.6 Contents of lysine detected by HPLC in fermentation broth of bacterium

根據(jù)標準品各個濃度峰面積制作標準曲線如圖6a，給出回歸方程；Lys標準品衍生液HPLC結(jié)果如圖6b。Bacillus subtilisHPLC檢測結(jié)果和重組菌HPLC檢測結(jié)果見圖6c、6d。野生菌Lys含量是17.32 μg·mL-1，重組菌 Lys含量是 20.1 μg·mL-1，結(jié)果重組菌發(fā)酵液Lys含量比野生菌提高16.05%(n=5)。目峰出峰時間約在14.224 min。

3 討論與結(jié)論

本研究所用Cflr是高賴氨酸蛋白基因，該基因所編碼蛋白質(zhì)中賴氨酸含量為21.2%，是目前已知賴氨酸含量最高天然蛋白[5]?，F(xiàn)已報道天然存在高賴氨酸蛋白基因還有sb401、SBgLR、st901、tsb和wblrp，但這些基因所表達蛋白質(zhì)中賴氨酸含量都低于Cflr。為提高益生菌枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑中賴氨酸含量，本研究從辣椒花藥中克隆Cflr基因，并利用基因工程手段將Cflr轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中，從而使枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中賴氨酸含量提高16.05%。李學(xué)琳等從四棱豆中克隆wblrp基因，并將其轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中，使枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中賴氨酸含量提高9.85%[3]。與之相比，本研究更進一步。目前關(guān)于Cflr研究不多，孫曉波等構(gòu)建高賴氨酸蛋白基因（Cflr）植物表達載體pAHC25-Cflr，并將其轉(zhuǎn)入植物小麥中[9]。而本研究將Cflr轉(zhuǎn)入微生物枯草芽孢桿菌中屬首例。

枯草芽孢桿菌遺傳背景清楚[10]，蛋白分泌機制健全、生長迅速、培養(yǎng)簡便、不分泌內(nèi)毒素，具有較好生物安全性，是美國食品藥物管理局（FDA）和中國農(nóng)業(yè)部批準使用安全菌株；可直接將表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，產(chǎn)物便于提取和純化，是表達外源基因良好受體菌。本試驗采用野生型宿主菌B.subtilis168是枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)中最為廣泛應(yīng)用的宿主菌，在本試驗中外源基因表達成功（在24 ku處出現(xiàn)目條帶）。益生菌枯草芽孢桿菌作為外源蛋白宿主菌已成功表達多種類型基因[11]，Liu等實現(xiàn)芽孢桿菌akibiⅠ-1內(nèi)切葡聚糖酶在枯草芽孢桿菌168中過量表達[12]；Abbasi-Hosseini等克隆克勞氏芽孢桿菌中堿性絲氨酸蛋白基因，并在枯草芽孢桿菌WB600中成功表達，重組枯草芽孢桿菌比原始菌株產(chǎn)堿性蛋白酶活性增強3倍[13]；李爽等構(gòu)建pHT43-VP2重組表達載體，并轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌WB600中誘導(dǎo)表達。結(jié)果表明在69 ku處存在目蛋白[14]；郭菁等將構(gòu)建重組質(zhì)粒通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌蛋白酶缺失菌株WB600中，轉(zhuǎn)化子pWT22-BLG4/WB600在IPTG（1.0 mmol·L-1）誘導(dǎo)下，發(fā)酵液上清中蛋白酶活達到620 U·mL-1，高于出發(fā)菌株G4BLG4酶活（240 U·mL-1）[15]；外源基因轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中例子還有很多，本研究在枯草芽孢桿菌中表達植物來源高賴氨酸蛋白基因Cflr，可為今后開展高賴氨酸蛋白基因在益生菌中高效表達和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

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