王嘉琪，馬小妮，周 建，葛寶豐，郭曉宇，陳克明

蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所，蘭州730050

骨代謝是一個由成骨細胞的骨形成和破骨細胞的骨吸收構成的動態(tài)平衡的過程。1987年，Gray等［1］首次在體外培養(yǎng)成骨細胞上發(fā)現(xiàn)了雌激素受體(estrogen receptor，ER)，揭示了雌激素對成骨細胞的直接影響。此外，電磁場已被證明能影響機體骨代謝，并廣泛應用于臨床上多種骨骼相關疾病的預防和治療［2-3］。自 Yasuda等［4］發(fā)現(xiàn)骨具有壓電效應以來，許多學者致力于低頻磁場治療骨質疏松的理論和實踐研究，但尚未見有關電磁場與ER關系的報道。本研究以原代培養(yǎng)的大鼠顱骨成骨細胞為研究對象，探討不同處理時間的靜磁場 (static magnetic fields，SMFs)對體外培養(yǎng)成骨細胞ER的影響，以期為SMFs的臨床應用提供依據(jù)。

材料和方法

SMFs發(fā)生儀實驗所用SMFs發(fā)生儀由本研究組與蘭州理工大學共同研制，線圈內徑為180 mm，頻率、磁感應強度均精確可調。磁感應信號經(jīng)計算機控制程序產(chǎn)生后，經(jīng)過信號放大器放大后傳入磁場線圈，基本原理如圖1［5］。經(jīng)中國人民解放軍蘭州軍區(qū)醫(yī)學計量測試研究站測定表明，SMFs發(fā)生儀運行期間磁場環(huán)境均勻穩(wěn)定 (報告編號:醫(yī)計磁字ccqd-2008-01)。儀器經(jīng)紫外線照射消毒后放入細胞培養(yǎng)箱內，由導線與外部控制裝置相連。實驗期間培養(yǎng)箱內CO2水平為5%，溫度控制在 (37±0.2)℃，濕度為100%。

大鼠、主要試劑及儀器出生48 h內的SPF級SD大鼠10只 ［甘肅省中醫(yī)學院動物實驗中心，合格證號SCXK(甘)2004-0006-152］;胎牛血清 (fetal bovine serum，F(xiàn)BS，蘭州民海生物公司)，α-MEM培養(yǎng)基、Ⅱ膠原酶 (美國Gibco公司)，地塞米松、磷酸化抗壞血酸、β-磷酸甘油鈉、胰蛋白酶 (美國Sigma公司)，噻唑藍 (methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，美國Sigma公司)，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ、熒光染料、PCR正向引物、PCR反向引物 (大連寶生物公司)，堿性磷酸酶試劑盒 (南京建成生物工程研究所)、茜素紅 (美國AMRESCO公司);CO2細胞培養(yǎng)箱 (美國Thermo Fisher公司)，倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS)，紫外分光光度計、臺式高速冷凍離心機 (德國Heraeus公司)，實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

圖1 靜磁場發(fā)生儀圖解Fig 1 Schematic of static electromagnetic fields device

成骨細胞分離培養(yǎng)將SD大鼠以75%酒精浸泡窒息后斷頭，無菌條件下取出頭蓋骨，置入盛有培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)皿中，去除骨膜、血管及結締組織，磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffer saline，PBS)漂洗2次，加入0.25%胰酶于37℃下消化15 min，吸除消化液，再加入0.1% Ⅱ型膠原酶37℃下消化4次，每次20 min，收集并合并消化液，用200目細胞篩過濾，過篩后的消化液離心10 min(1000 r/min，r=11.18 cm)，棄上清液，沉淀用 PBS漂洗后用含有10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基懸浮，吹打均勻后，調整細胞濃度至3×104/ml。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次。待細胞生長融合至80%以上時，0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳代后待單層細胞融合率達到80%以上時進行成骨性誘導。

成骨細胞鑒定將傳代后的成骨細胞接種于35 mm的中皿，實驗組和對照組分別進行堿性磷酸酶染色和鈣化結節(jié)染色。堿性磷酸酶染色方法參考文獻［6］，磁場暴露處理至第8 d時進行偶氮偶合染色，待出現(xiàn)紫色斑點后停止染色，觀察并照相記錄結果。茜素紅鈣化結節(jié)染色方法參考文獻 ［6］，磁場處理至第12 d，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗兩次，加入10%福爾馬林固定10 min，棄固定液，加入pH 8.9、0.1%的茜素紅染色液，37℃水浴1 h，流水沖洗，換固定液，照相記錄結果。

細胞分組與磁場處理將第1代傳代細胞 (passage 1，P1)分為9組，每組3個重復，用磁場強度為3.9 mT的SMFs分別處理0(對照組)、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 h。磁場中使用電子測溫計實時監(jiān)測電磁場線圈中的溫度，使其始終保持在 (37±0.2)℃，排除熱效應對培養(yǎng)細胞的影響。

細胞增殖分析將P1代細胞以3×104/ml接種于60 mm培養(yǎng)皿，24 h后每組分別用SMFs處理，對照組不用磁場處理。48 h后棄培養(yǎng)液，換為含10%MTT的無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)液，加入DMSO搖床震蕩10 min，待紫色結晶沉淀徹底溶解后，于酶標儀上測定490 nm處的光密度 (optical density，OD)值。

骨鈣素含量的測定成骨誘導培養(yǎng)后每3 d換液1次，每次換液時留取1 ml舊培養(yǎng)液，于-20℃保存，待SMFs處理后各時間點的樣品收集齊全后，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測SMFs處理第3、6、9、12天的骨鈣素分泌量，以μg/孔表示。

逆轉錄實時PCR分析分別在成骨性誘導培養(yǎng)0、24、48和72 h時提取總RNA，檢測ERα和ERβ的mRNA表達水平。所用引物均委托寶生物 (大連)公司根據(jù)GenBank所發(fā)布的序列設計并合成(表1)，總RNA的提取采用TRIzol，紫外分光光度計檢測濃度，并用1%甲醛變性瓊脂糖電泳檢測其完整性。調整總RNA的濃度至50 mg/L，取2μl進行逆轉錄。逆轉錄體系包括5×緩沖液4 μl，酶混合物1 μl，50 μmol/L 寡核苷酸引物 1 μL，100 μmol/L 隨機引物1 μL，總 RNA 2 μl，用 RNA 無酶水定容至20 μl。混勻后離心 30 s(3000 r/min，r=6.7 cm)，37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 5 min，取出置于-20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應體系為 20 μl，包括:SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ (2 × )10 μl、10 μmol/L 正向引物 0.8 μl、10 μmol/L 反向引物 0.8 μl、50 × 染液0.4 μl、模版 cDNA 2 μl、蒸餾水 6 μl。反應條件為95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火31 s，進行40個循環(huán)，每個循環(huán)的延伸末收集熒光信號。隨后緩慢升溫，95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，溫度變化速度為0.1℃/s，進行PCR反應，制備標準曲線。經(jīng)內參校正，得到目的基因的相對表達水平。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，結果均以均數(shù)±標準差表示，采用方差分析檢驗各組間是否有顯著性差異，當存在有統(tǒng)計學意義的差異時，采用多參數(shù)單因素方差分析檢驗各均數(shù)間差異是否有統(tǒng)計學意義，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

成骨細胞鑒定結果培養(yǎng)之初細胞呈三角形、紡錘形或多角形，48 h后數(shù)量明顯增加，體積增大，3～4 d細胞有克隆形態(tài) (圖2A)。細胞培養(yǎng)8 d后堿性磷酸酶組織化學染色鑒定呈陽性 (圖2 B);細胞培養(yǎng)12 d后茜素紅染色鑒定呈陽性 (圖2 C)。

表1 逆轉錄實時PCR的引物序列Table 1 The primer sequences of reverse transcription-real time polymerase chain reaction

圖2 成骨細胞形態(tài) (×100)Fig 2 Characterization of osteoblasts(×100)

對細胞增殖的影響與對照組比較，SMFs處理2.0 h組和3.0 h組的細胞增殖顯著增加 (P＜0.05)，2.5 h組的細胞增殖增加也有統(tǒng)計學意義 (P＜0.01)，其他各組的差異均無統(tǒng)計學意義 (表2)。

對骨鈣素的影響各組骨鈣素的含量第3～9天呈升高趨勢，第12天略有下降。SMFs處理第3天時，2.5 h組的骨鈣素含量顯著高于1.5 h組 (P＜0.05)。SMFs處理第6天時，1.0 h組骨鈣素含量顯著高于對照組 (P＜0.05)，1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h組也顯著高于對照組 (P＜0.01)，2.5 h組骨鈣素含量顯著高于 0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、3.5 h和4.0 h組 (P＜0.05)。SMFs處理第9天時，1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h組骨鈣素含量顯著高于對照組 (P＜0.05)，2.5 h組骨鈣素含量顯著高于0.5、1.0和3.0 h組 (P＜0.01)。SMFs處理第12天時，2.5 h組骨鈣素含量顯著高于對照組、1.5 h組和4.0 h組 (P＜0.05)(圖3)。

表2 磁場處理48 h后細胞增殖結果 (±s)Table 2 MTT test results after 48h of SMFs treatment(±s)

表2 磁場處理48 h后細胞增殖結果 (±s)Table 2 MTT test results after 48h of SMFs treatment(±s)

OD490:490 nm吸光值OD490:optical density value at 490 nm

組別Group樣本含量Sample number OD490P 0 h 3 2.369±0.0640 —0.5 h 3 2.367±0.1111 0.9789 1.0 h 3 2.304±0.0461 0.3536 1.5 h 3 2.287±0.1974 0.4902 2.0 h 3 2.432±0.0519 0.0221 2.5 h 3 2.591±0.0419 0.0084 3.0 h 3 2.463±0.0960 0.0387 3.5 h 3 2.333±0.3581 0.8675 4.0 h 3 2.507±0.1268 0.0740

圖3 磁場處理后骨鈣素含量的變化Fig 3 The content of osteocalcin in SMFs treated rat osteoblasts

實時熒光PCR實驗結果SMFs處理成骨細胞0 h后，與對照組比較，1.0 h、2.5 h、3.0 h和3.5 h組的ERα mRNA的表達水平顯著升高 (P＜0.05)，SMFs處理組之間比較，2.5 h組的ERα mRNA表達水平顯著高于1.5 h、2.0 h、3.5 h和4.0 h組 (P＜0.05)。SMFs處理 24 h后，0.5 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h和3.5 h組的ERα mRNA表達量顯著低于對照組 (P＜0.05)，2.5 h組的ERα mRNA表達水平顯著高于0.5 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h和 3.5 h組 (P＜0.01)。SMFs處理 48 h后，1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h和3.0 h組的ERα mRNA表達水平顯著低于對照組 (P＜0.05)，2.5 h組顯著高于0.5 h、2.0 h和3.0 h組 (P＜0.05)。SMFs處理72 h后，1.0 h、1.5 h和2.5 h組ERα mRNA表達水平顯著高于對照組 (P＜0.05)，而3.0 h、3.5 h和4.0 h組顯著低于對照組 (P＜0.05);2.5 h組的ERα mRNA表達水平顯著高于其他7個SMFs處理組 (P＜0.05)(圖4)。

SMFs處理成骨細胞0 h后，除了2.5 h組 ERβ mRNA的表達顯著高于對照組外 (P＜0.01)，其他各組的ERβ mRNA表達均受到不同程度的抑制，而2.5 h組的ERβ mRNA表達水平顯著高于其他SMFs處理組 (4.0 h組除外，P＜0.05)。SMFs處理24 h后，除2.0 h和2.5 h組外，各SMFs處理組的ERβ mRNA表達水平均顯著低于對照組 (P＜0.05)。SMFs處理48 h后，0.5 h、2.5 h和3.5 h組ERβ mRNA表達顯著高于對照組 (P＜0.01)，1.5 h、2.0 h、3.0 h和4.0 h組的ERβ mRNA表達顯著低于對照組 (P＜0.05);2.5 h組ERβ mRNA的表達顯著低于0.5 h組 (P＜0.01)，而顯著高于1.0 h、2.0 h、3.0 h、3.5 h和4.0 h組 (P＜0.05)。SMFs處理72 h后，各SMFs處理組的ERβ mRNA表達水平均顯著低于對照組組 (P＜0.05);2.5 h組的ERβ mRNA表達水平顯著低于0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.5h和4.0 h組 (P＜0.05)(圖5)。

討 論

成骨細胞是骨中占主導地位的細胞，是機械和電刺激通過連接間隙傳送信號的基本條件［7］，也是骨發(fā)生和骨形成的物質基礎，在骨組織的更新活動中是最重要的功能細胞。電磁場具有促成骨效應，臨床上已被用于緩解骨質疏松癥狀，促進骨折愈合，治療骨不連、骨移植、骨壞死等［8］。有大量證據(jù)表明骨再生與雌激素樣作用有著不可分割的聯(lián)系［9-10］，但有關SMFs不同處理時間對成骨細胞ER的影響仍存在爭議。本研究觀察了強度為3.9 mT、處理時間分別為 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h的SMFs對成骨細胞成熟分化及雌激素受體ERα和ERβ基因表達的影響。

圖4 SMFs對ERα mRNA表達水平的影響Fig 4 Effect of SMFs on ERα mRNA expression in SMFs-treated rat osteoblasts

圖5 SMFs對ERβ mRNA表達水平的影響Fig 5 Effect of SMFs on ERβ mRNA expression in SMFs-treated rat osteoblasts

細胞增殖是生物最根本、最基礎的生命活動，是個體生長和生命延續(xù)的基本保障。外界的刺激會使細胞周期發(fā)生變化，影響細胞增殖，而成骨細胞的增殖對于骨缺損、骨不連等骨病非常重要［11］。Kotani等［12］將大鼠成骨細胞MC3T3-El暴露于8 T強靜磁場60 h，結果顯示高強度磁場能通過增強堿性磷酸酶的活性來促進成骨細胞分化，但對成骨細胞的增殖并無明顯影響。與此結果不同，本研究發(fā)現(xiàn)，SMFs處理成骨細胞2.0、2.5、3.0 h時，可顯著促進細胞增殖。

由成骨細胞分泌的骨鈣素被認為是評價成骨功能的特異指標，直接反映成骨細胞的活性和骨生理代謝變化［13］，骨鈣素可能參與調節(jié)鈣代謝，在骨組織發(fā)育中發(fā)揮鈣化作用，促進骨基質成熟，在骨質疏松發(fā)生發(fā)展過程中的作用受到較多關注。本研究結果表明，SMFs的處理時間對成骨細胞的骨鈣素含量有一定影響，其中SMFs處理2.5 h時骨鈣素含量的變化最為明顯。

雌激素通過與成骨細胞上的ER特異性結合，能直接增強成骨細胞功能，從而促進骨形成，調節(jié)雌激素與骨吸收、骨形成之間的關系，從而對骨代謝及骨重建起到重要的調控作用，因此ER是骨質疏松癥發(fā)生過程中的關鍵物質［14］。楊永紅等［15］認為低頻脈沖電磁場對骨質疏松的預防性治療作用機理不是通過提高雌激素水平途徑實現(xiàn)的。本研究結果表明，SMFs的處理時間對成骨細胞ERα和ERβ的基因表達有一定的影響。在SMFs處理成骨細胞0 h時，1.0 h、2.5 h、3.0 h和3.5 h組 ERα mRNA表達量顯著高于對照組;處理72 h時，1.0 h、1.5 h和2.5 h組ERα mRNA表達量顯著高于對照組。與之相反，SMFs處理 0 h時，0.5 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h、3.5 h和4.0 h組ERβ mRNA表達量顯著低于對照組;處理72 h時，所有磁場處理組ERβ mRNA表達量均顯著低于對照組。這一結果提示ERα和ERβ在成骨細胞中的共同表達調控作用，且ERα和ERβ的表達調控方向相反。

本研究探討了SMFs對體外培養(yǎng)成骨細胞增殖、分化及ER基因表達水平的影響，發(fā)現(xiàn)在采用SMFs處理體外培養(yǎng)成骨細胞時，處理時間為2.5 h時的作用效果最為明顯。以本研究結果為基礎，進一步探索電磁場與ER表達之間的關系，有望為磁場治療骨質疏松癥提供細胞水平的實驗依據(jù)。

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