程博涵，冷 麗，李 輝

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic pro?teins,BMPs）是多功能細(xì)胞因子，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族，能夠誘導(dǎo)血管周圍及結(jié)締組織中未分化的間充質(zhì)細(xì)胞向骨和軟骨細(xì)胞方向分化，從而形成骨組織，最早由Urist發(fā)現(xiàn)[1]。BMP4是BMPs家族中的一種，參與機(jī)體細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、遷移及細(xì)胞外基質(zhì)的形成等眾多生理、病理活動(dòng)的調(diào)控。BMP4基因在卵巢組織中高豐度表達(dá)，且在垂體、下丘腦、子宮、脂肪、心臟等多種組織中均有表達(dá)。BMP4不僅具有促進(jìn)軟骨和骨組織形成的作用，可促進(jìn)原始卵泡發(fā)育及向初級(jí)卵泡的轉(zhuǎn)化[2]。近期研究表明，BMP4在多潛能干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞定向分化的過程中也發(fā)揮著重要作用[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎發(fā)育早期，BMP4對(duì)器官的發(fā)生和發(fā)育同樣具有重要意義[6]。

本研究基于NCBI數(shù)據(jù)庫上的雞BMP4基因全長(zhǎng)mRNA序列，應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)其編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)、信號(hào)肽、結(jié)構(gòu)域、Motif、三維結(jié)構(gòu)等方面的預(yù)測(cè)，并分析其生物學(xué)功能。此外，本研究基于NCBI數(shù)據(jù)庫上10個(gè)物種的BMP4 mRNA序列，對(duì)其編碼的氨基酸進(jìn)行序列比對(duì)，并進(jìn)行同源性和進(jìn)化關(guān)系分析，旨在為雞BMP4功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 各物種BMP4基因序列

利用NCBI數(shù)據(jù)庫獲取BMP4基因序列：雞NM_205237，小鼠 NM_007554.2，馬 NM_00116 3970，綿羊NM_001110277，人NM_001202，非洲爪蟾NM_001101793，豬NM_001101031，牛NM_001045877，斑馬魚NM_131342，山羊EF632080。

1.2 物種間BMP4氨基酸同源性及進(jìn)化關(guān)系分析

利用DNAMAN軟件對(duì)BMP4基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并進(jìn)行同源性和進(jìn)化關(guān)系分析。

1.3 BMP4理化性質(zhì)分析

利用ProtParam和ProtScale工具對(duì)BMP4的氨基酸組成、分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)和疏水性進(jìn)行分析。

1.4 BMP4信號(hào)肽和跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

信號(hào)肽能指導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜分泌和定位。本研究中BMP4信號(hào)肽和蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測(cè)分別采用SignalP4.0 Server和TMHMM程序進(jìn)行分析。

1.5 BMP4結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)中能折疊成特定三維結(jié)構(gòu)的一段區(qū)域，具有相同結(jié)構(gòu)域的蛋白被稱作一個(gè)蛋白家族。本研究使用EMBL網(wǎng)站的SMART工具對(duì)BMP4的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

1.6 BMP4 Motif搜索

Motif是蛋白質(zhì)序列中較短的保守區(qū)域，通常可以決定一個(gè)蛋白家族。本研究利用ExPASy網(wǎng)站上的ScanProsite工具對(duì)BMP4中的Motif進(jìn)行搜索。

1.7 BMP4同源建模和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)在體內(nèi)發(fā)揮功能的存在形式，能夠提供豐富的功能信息。本研究應(yīng)用SWISS-MODEL Workspace蛋白質(zhì)建模平臺(tái)對(duì)BMP4進(jìn)行同源建模和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 物種間BMP4氨基酸序列同源性及進(jìn)化關(guān)系分析

將雞、非洲爪蟾、斑馬魚、小鼠、人、豬、山羊、牛、綿羊和馬的BMP4氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)BMP4氨基酸序列比較保守，哺乳動(dòng)物間序列同源性很高（見圖1a）。進(jìn)化聚類分析顯示，由該基因構(gòu)建的生物進(jìn)化關(guān)系圖譜與已知物種進(jìn)化關(guān)系基本一致（見圖1b）。

圖1 BMP4氨基酸序列聚類分析Fig.1 Cluster analysis of BMP4 amino acid sequence

2.2 BMP4理化性質(zhì)分析

使用ProtParam工具對(duì)BMP4理化性質(zhì)進(jìn)行分析（見表1）。

表1 BMP4各種氨基酸殘基含量Table 1 The content of a variety of amino acid residues of BMP4

BMP4各種氨基酸殘基的含量：亮氨酸含量最高（9.9%），精氨酸次之（8.9%），色氨酸最低（1.5%），半胱氨酸含量為2.0%。BMP4的分子質(zhì)量為46 ku，理論等電點(diǎn)為9.07。利用ProtScale工具中的Kyte-Doolittle法進(jìn)行疏水性分析，Window size設(shè)置為11，結(jié)果顯示BMP4為親水性蛋白（-0.507），其N端氨基酸1～23有1個(gè)疏水區(qū)段（2.975），而在氨基酸280～305有1個(gè)親水區(qū)段（-3.653）（見圖2）。

2.3 BMP4信號(hào)肽預(yù)測(cè)和跨膜區(qū)分析

通過SignalP-4.0 Server工具分析發(fā)現(xiàn)BMP4具有信號(hào)肽（氨基酸1～23），可能的剪切位點(diǎn)位于23和24位氨基酸之間（TNH-AS D=0.747，D-cut?off=0.450），含有信號(hào)肽酶識(shí)別的AXXA結(jié)構(gòu)（見圖3）。

圖2 BMP4疏水性分析Fig.2 Hydrophobicity of BMP4

圖3 BMP4信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.3 Signal peptide prediction of BMP4

使用TMHMM工具進(jìn)行跨膜區(qū)分析，結(jié)果表明BMP4沒有跨膜區(qū)，并處于細(xì)胞膜外部（見圖4），很可能是一種分泌性蛋白，證實(shí)該蛋白可以在細(xì)胞外與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，從而發(fā)揮生物學(xué)功能。

2.4 BMP4結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

SMART工具分析BMP4結(jié)構(gòu)域結(jié)果顯示，該蛋白具有TGF-β蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域，位于氨基酸304～404，是BMP4的成熟肽區(qū)，該結(jié)構(gòu)域具有7個(gè)保守的半胱氨酸殘基，其中6個(gè)形成分子內(nèi)二硫鍵，1個(gè)參與分子間二硫鍵的形成（即半胱氨酸結(jié)），使2個(gè)多肽鍵連接成二聚體；氨基酸1～23為信號(hào)肽區(qū)；氨基酸26～275為TGF-β家族前肽區(qū)，與成熟肽區(qū)之間有一蛋白酶切位點(diǎn)RXXR，并且沒有跨膜區(qū)及復(fù)合螺旋區(qū)。

結(jié)果見圖5。

圖4 BMP4跨膜區(qū)預(yù)測(cè)Fig.4 Transmembrane region prediction of BMP4

圖5 BMP4結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.5 Domain prediction of BMP4

2.5 BMP4 Motif搜索

使用ExPASy網(wǎng)站上的ScanProsite工具進(jìn)行雞BMP4的Motif搜索，共找到20個(gè)Prosite位點(diǎn)。其中包括：1個(gè)TGF-β2家族保守結(jié)構(gòu)，位于氨基酸287～404；1個(gè)TGF-β1家族標(biāo)簽，位于氨基酸322～337；1個(gè)雙向核定位基序，位于氨基酸286～302；3個(gè)N-肉豆蔻酸化位點(diǎn)，位于氨基酸20～25（GTNHAS） 、 40～45 （GQAGSG） 、 262～267（GGDWAQ）；8個(gè)PKC磷酸化位點(diǎn)，位于氨基酸30～32（TGR）、 44～46（SGR）、 111～113（TSR）、116～118（TVR）、189～191（SER）、285～287（TRR）、291～293（SPK）、297～299（SRK）；2個(gè)酰胺化位點(diǎn)，位于氨基酸30～33（TGRK）和44～47（SGRR）；5個(gè)酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，位于氨基酸92～95（SGEE）、98～101（SLQE）、146～149（SVPD）、154～157（SSAE）、209～212（TRWE）；4個(gè) N-糖基化位 點(diǎn) ， 位 于 氨 基 酸 143～146（NLSS）、 207～210（NVTR）、346～349（NSTN）、361～364（NSSI）。

2.6 BMP4同源建模和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

應(yīng)用SWISS-MODEL Workspace平臺(tái)對(duì)BMP4編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行同源性建模和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。反饋結(jié)果提示：BMP4成熟肽和2h62B[7-9]（1.85A）（303～404）有91.18%的氨基酸序列一致，E值為8.45e-56。SWISS-MODEL Workspace平臺(tái)以2h62B為模板推測(cè)出了BMP4的三維結(jié)構(gòu)（見圖6）。

圖6 BMP4三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Three-dimensional structure prediction of BMP4

3 討論與結(jié)論

隨著人類和真核生物基因組測(cè)序完成，現(xiàn)代基因工程學(xué)已經(jīng)步入后基因組時(shí)代[10]。面對(duì)核酸、蛋白序列及結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)資源增長(zhǎng)，生物信息學(xué)應(yīng)運(yùn)而生并逐步發(fā)展，逐漸成為生命科學(xué)在信息時(shí)代的核心內(nèi)容之一。本研究利用生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)資源，對(duì)雞BMP4的蛋白性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能以及不同物種間BMP4氨基酸序列的同源性及進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行比較詳細(xì)的分析。

BMP4是一種生長(zhǎng)因子，疏水性、信號(hào)肽、跨膜區(qū)分析表明雞BMP4具有信號(hào)肽（氨基酸1～23，含有信號(hào)肽酶識(shí)別的AXXA結(jié)構(gòu)），無跨膜區(qū)，可能位于細(xì)胞外，并通過與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合而向特定細(xì)胞傳遞信號(hào)；氨基酸280～305有一個(gè)親水區(qū)段（-3.653），包含蛋白酶切位點(diǎn)RXXR，為BMP4成熟肽剪切位點(diǎn)。結(jié)構(gòu)域和Motif搜索發(fā)現(xiàn)，該蛋白成熟肽具有TGF-β超家族結(jié)構(gòu)域（7個(gè)半胱胺酸殘基），其中6個(gè)形成分子內(nèi)二硫鍵，即半胱氨酸結(jié)，1個(gè)在BMP4構(gòu)成二聚體（同源或異源）的過程中形成分子間二硫鍵，維持蛋白構(gòu)象并保持生理功能；同時(shí)，BMP4分子中存在N-肉豆蔻酸化、PKC磷酸化、酰胺化、酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化以及N-糖基化等位點(diǎn)。蛋白三維結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，雞BMP4成熟肽序列與2h62B相似性達(dá)到91.18%。進(jìn)化聚類分析顯示，由該基因構(gòu)建的生物進(jìn)化關(guān)系圖譜與已知物種進(jìn)化關(guān)系基本一致，這說明該基因在物種進(jìn)化過程中發(fā)生一定程度突變，BMP4信號(hào)通路是自然選擇的作用位點(diǎn)。

生物信息學(xué)分析表明雞BMP4具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，可作為信號(hào)分子在軟骨和骨形成、原始卵泡發(fā)育、干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞定向分化以及早期胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮作用。本研究為雞BMP4功能的研究提供理論依據(jù)，但對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能推測(cè)還需試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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