藥 璐，閔偉紅，姜鐵民，陳歷俊,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2.北京三元食品股份有限公 司，北京 100076)

隨著人們生活水平和健康消費(fèi)意識(shí)的提高，發(fā)酵酸乳以其獨(dú)特的風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值日益受到人們的重視。尤其是添加益生菌的發(fā)酵乳制品，其無論是在產(chǎn)品特性還是在保健功能上都受到廣泛關(guān)注。因此許多產(chǎn)品都利用益生菌與傳統(tǒng)的乳酸菌嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )和保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)共同發(fā)酵生產(chǎn)酸乳制品[1-3]。

益生菌具有提高免疫力、降低膽固醇、治療風(fēng)濕病、抗 癌、提高乳糖耐受性、阻止或降低特異性皮炎和局限性回腸炎、治療鏈球菌病、泌尿系統(tǒng)感染等功能[4-6]。這也是消費(fèi)者喜愛益生菌發(fā)酵酸乳的原因，另一方面由于益生菌的發(fā)酵分解作用，使酸乳中游離氨基酸、維生素、糖類和礦物質(zhì)含量高于鮮牛乳[7]。因此益生菌發(fā)酵酸乳作為營養(yǎng)性保健食品在世界范圍內(nèi)迅速發(fā)展，其營養(yǎng)功效也非常明顯。由于受蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物如多肽、氨基酸以及氨基酸的代謝產(chǎn)物等的影響，不同菌種發(fā)酵酸乳的品質(zhì)和功能特性也有很大差異[8]。目前國內(nèi)關(guān)于益生菌對(duì)發(fā)酵酸乳蛋白的影響還未有深入的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)選用目前常用的兩株益生菌：干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)和植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)與傳統(tǒng)的乳酸菌共同發(fā)酵，以響應(yīng)面優(yōu)化后的最優(yōu)生產(chǎn)工藝條件制備發(fā)酵酸乳。通過對(duì)比分析探討了益生菌對(duì)發(fā)酵酸乳蛋白的影響，為研究益生菌在酸乳中的發(fā)酵機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus，St)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus，Lb)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei，Lc) 丹尼斯克(中國)有限公司；植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum，Lp) 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；脫脂乳粉 新西蘭進(jìn)口脫脂乳粉；蛋白Marker 北京全式金生物技術(shù)有限公司；十二烷基磺酸鈉(SDS)、巰基乙醇、過硫酸銨、TEMED、Tris堿、游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma-Aldrich公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺 美國Amresco公司；乙腈、三氟乙酸 美國Thermo Fisher Scientif ic公司；AccQ·TagTMUltra緩沖鹽溶液 美國Waters公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mini Protean Ⅱ蛋白電泳儀 美國Bio-Rad公司；UVP GDS-8000凝膠成像儀 上海天能公司；Cintra20紫外-可見光分光光度計(jì) 澳大利亞GBC公司；高效液相色譜儀 日本島津公司；超高效液相色譜儀 美國Waters公司；冷凍干燥離心機(jī) 德國Sigma公司；PB-10型pH計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酸乳生產(chǎn)工藝

脫脂乳粉120g/L復(fù)原→滅菌(110℃，10min)→冷卻→接菌→分裝→發(fā)酵→冷藏后熟(4.0℃，24h)→成品。不同菌種的實(shí)驗(yàn)條件如表1所示。

表 1 不同菌種組合發(fā)酵酸乳的實(shí)驗(yàn)條件Table 1 Fermentation conditions for yogurt with different strains

1.3.2 樣品的處理

取1mL發(fā)酵酸乳樣品，加入所需稀釋倍數(shù)的雙蒸水，將發(fā)酵樣品配成蛋白質(zhì)量濃度約2～5mg/mL的溶液，吸取20μL液體，加入等體積的樣品緩沖溶液，沸水浴10min，然后12000r/min離心10min，用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的測定。

取適量的發(fā)酵酸乳樣品，用手持均質(zhì)機(jī)均質(zhì)2min，將pH值調(diào)至4.6，室溫靜置30min，4500r/min離心30min，上清液(pH4.6可溶性部分)用Whatman硬化 無灰級(jí)定量濾紙(NO.42，2.50μm)過濾，濾液保存于－20℃待用，用于氨基氮含量的測定。上清液(pH4.6可溶性部分)用0.22μm的膜過濾，濾液保存于－20℃?zhèn)溆?，用于pH4.6可溶性氮的測定。濾液用1.00mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至8.20～10.00之間，最后用0.22μm的膜過濾后保存于－20℃待用，用于游離氨基酸的分析測定。

1.3.3 SDS-PAGE電泳

SDS-PAGE電泳測定方法參照文獻(xiàn)[9]，12%分離膠和4%濃縮膠。采用恒壓電泳，80V預(yù)電泳，待樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)整電壓為120V。待指示劑溴酚藍(lán)前沿到達(dá)電泳槽底部時(shí)，停止電泳。

1.3.4 氨基氮含量的測定

氨基氮包括游離氨基酸和小肽，采用鄰苯二甲醛(o-phthaldialdehyde，OPA)分光光度法測定12%TCA可溶性組分中氨基氮的含量[10]，伯氨基(α-氨基和ε-氨基)與鄰苯二甲醛和β-巰基乙醇反應(yīng)形成的加合物在340nm有強(qiáng)烈的光吸收。取50μL已過濾的上清液，加入1mL鄰苯二甲醛試劑中，室溫下計(jì)時(shí)反應(yīng) 2min，340nm波長處測定吸光度。

鄰苯二甲醛試劑的配制：準(zhǔn)確稱取40mg OPA溶解于1.0mL甲醇中，加入100μL β-巰基乙醇、0.95g四硼酸鈉(Na2B4O7·H2O)、0.50gSDS，溶解后定容50mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：配制1.0mg/mL亮氨酸溶液，稀釋為質(zhì)量濃度分別為50、100、200、300、400、500μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，按照上述方法測定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中氨基氮的含量。

1.3.5 反相高效液相色譜法(RP-HPLC)檢測pH4.6可溶性氮的變化

表 2 RP-HPLC梯度洗脫程序Table 2 RP-HPLC Gradient elution procedure

采用Waters公司的RP-HPLC對(duì)其進(jìn)行測定，色譜柱選用Agela Venusil XBP C18(250mm×4.6mm， 孔徑150?，5.0μm粒徑)色譜柱，柱溫35℃；流動(dòng)相包括溶劑A：0.10%三氟乙酸(TFA)水溶液，溶劑B：0.10%三氟乙酸(TFA)乙腈溶液；流速：0.80mL/min；檢測波長：214nm；進(jìn)樣量：10μL；梯度洗脫程序如表2所示。

1.3.6 游離氨基酸含量的測定

采用Waters公司的UPLC進(jìn)行游離氨基酸分析，色譜柱選用ACCQ·TagTMUltra氨基酸色譜柱(2.1mm×100mm)。AccQ·TagTMUltra緩沖鹽溶液配制：取12.50mL的AccQ·TagTMUltra緩沖鹽溶液定容到250mL即可。

用AccQ·TagTMUltra方法進(jìn)行氨基酸的柱前衍生，具體方法如下。1)將10μL樣品和70μL AccQ-TagTMUltra硼酸鹽緩沖劑添加到完全回收樣品瓶中振蕩數(shù)秒，對(duì)照組為80μL AccQ-TagTMUltra硼酸鹽緩沖劑。2)加入20μL AccQTagTMUltra試劑，立即渦旋混合幾秒鐘，靜置1min。3)將樣品置于55℃培養(yǎng)箱中保持10min，取出，排氣泡后用于游離氨基酸含量的測定。流動(dòng)相A：AccQ·TagTMUltra緩沖鹽溶液，流動(dòng)相B：乙腈。進(jìn)樣量1μL。梯度洗脫程序及其他儀器參數(shù)設(shè)置如表3、4。游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：將2.50μmol/mL的17種氨基酸混標(biāo)，稀釋到濃度分別為0.02、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，按照上述梯度洗脫程序進(jìn)行測定，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表 3 UPLC梯度洗脫程序Table 3 UPLC Gradient elution procedure

表 4 樣品管理器、溶劑管理器及PDA檢測器參數(shù)Table 4 Parameters of sample manager, solvent manager and PDA detector

2 結(jié)果與分析

2.1 酸乳樣品蛋白的變化

圖 1 酸乳樣品稀釋6倍電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of 6-fold diluted yogurt samples

SDS-PAGE電泳方法具有重復(fù)性高、線性關(guān)系良好等優(yōu)點(diǎn)，普遍用于分離分子質(zhì)量為20～100ku之間的蛋白質(zhì)。由圖1可知，當(dāng)酸乳樣品稀釋6倍時(shí)，大分子蛋白分離效果較好，而且從電泳圖可以明顯的看出無論是單菌種St、Lb、Lc、Lp發(fā)酵酸乳，還是混合菌種發(fā)酵酸乳St＋Lb、St＋Lb＋Lc、St＋Lb＋Lp，其大分子蛋白種類都沒有變化，但同時(shí)也可以看到與普通乳酸菌發(fā)酵酸乳的條帶相比，添加益生菌的發(fā)酵酸乳中的αs2酪蛋白、αs1酪蛋白和β-乳球蛋白條帶比較淺，其中St＋Lb＋Lp發(fā)酵酸乳所形成的條帶最淺。其蛋白質(zhì)含量的降低主要是由于發(fā)酵劑中蛋白酶將蛋白質(zhì)逐步降解成多肽、小肽及氨基酸導(dǎo)致，且由于兩株益生菌在酸乳發(fā)酵過程中代謝活性不同而導(dǎo)致對(duì)蛋白質(zhì)的降解程度有所不同。

2.2 氨基氮含量的變化

12%TCA中的主要成分是中肽、小肽(具有2～20個(gè)氨基酸殘基)以及少量的氨基酸[11]。它主要是由發(fā)酵劑含有的凝乳酶和肽酶共同作用而產(chǎn)生的。在酸乳發(fā)酵后期，乳酸菌釋放出的蛋白酶進(jìn)一步降解蛋白質(zhì)生產(chǎn)小肽和氨基酸，其中氨基酸對(duì)酸乳風(fēng)味的形成起著很重要的作用[12]。

表 5 不同菌種發(fā)酵酸乳的氨基氮含量Table 5 Contents of amino nitrogen in yogurt samples fermented by different strains

由表5可知，添加益生菌的發(fā)酵酸乳與普通乳酸菌發(fā)酵酸乳相比，氨基氮含量有了一定程度的升高，其中添加干酪乳桿菌的酸乳其氨基氮含量有顯著增加(P＜0.05)，達(dá)到500.88μg/mL，比乳酸菌酸乳高出4.65%；添加植物乳桿菌的酸乳其氨基氮含量比乳酸菌酸乳高出0.31%。這主要是由于益生菌含有的蛋白酶對(duì)多肽產(chǎn)生作用，使其進(jìn)一步降解為小肽和氨基酸所造成的[13]。

2.3 pH4.6可溶性氮的變化

pH4.6可溶性氮是指多肽類，陳歷俊等[7]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH4.6時(shí)酪蛋白沉淀，乳清蛋白和蛋白胨對(duì)可溶性氮的貢獻(xiàn)很小，因此認(rèn)為pH4.6可溶性氮主要是由于乳酶的作用產(chǎn)生的。但隨著發(fā)酵、成熟時(shí)間的延長，它們便主要由發(fā)酵劑中蛋白酶降解蛋白質(zhì)所產(chǎn)生[14]。

RP-HPLC主要用于分子質(zhì)量低于5000u，尤其是1000u以下的非極性小分子多肽的分離和純化[15-16]，因其具有分離效果好、分辨率高、重復(fù)性好、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，在多肽的分離純化和制備中得到廣泛應(yīng)用[17]。目前國外就有報(bào)道稱發(fā)酵乳品中存在由乳酸菌的發(fā)酵作用而產(chǎn)生的多肽類物質(zhì)[18]。

圖 2 pH4.6-SN高效液相色譜分析圖Fig.2 HPLC analysis of pH4.6-SN in yogurt samples fermented by different strains

由圖2可以看出，與乳酸菌發(fā)酵酸乳相比，無論是添加干酪乳桿菌還是植物乳桿菌發(fā)酵的酸乳，多肽的種類并沒有增加，只是部分多肽含量發(fā)生了一些變化。當(dāng)出峰時(shí)間為26.943min時(shí)，可以明顯看到空白樣品中有一個(gè)比較大的峰，而添加菌種之后的發(fā)酵酸乳，此峰不明顯甚至消失，說明發(fā)酵菌種對(duì)酸乳中的此段多肽進(jìn)行了降解。當(dāng)出峰時(shí)間在20～32min時(shí)，可以明顯看到添加益生菌的酸乳中多肽含量明顯比乳酸菌發(fā)酵酸乳的少很多，這可能是由于益生菌將多肽降解為更小的肽段所造成的。總之，添加益生菌的酸乳色譜圖與乳酸菌發(fā)酵酸乳的色譜圖趨勢基本一致，說明在酸乳發(fā)酵過程中，乳酸菌仍然起主要作用，益生菌只是改變了部分多肽的含量。

2.4 游離氨基酸含量的變化

采用17種游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積與濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線如表6所示。在酸乳發(fā)酵過程中，發(fā)酵劑中含有的蛋白酶能降解酸乳中的蛋白質(zhì)，形成胨、肽、氨基酸等，所產(chǎn)生的一些小肽和氨基酸是酸乳主要風(fēng)味物質(zhì)的前體，而氨基酸代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)有助于酸乳形成最終優(yōu)良的感官品質(zhì)[19]。Beshkova等[20]對(duì)酸奶發(fā)酵過程的研究表明，牛奶凝結(jié)(發(fā)酵4.50h)后，牛奶總氨基酸的70%將以游離氨基酸的形式釋放到酸奶中，這是影響酸奶制品風(fēng)味和質(zhì)地的重要組成成分。另外研究表明，在混合菌株發(fā)酵中，菌株間的共生作用也必須有適量的氨基酸以促進(jìn)菌株的生長。乳桿菌可產(chǎn)生大量的游離氨基酸，作為氮源，促進(jìn)乳球菌的生長，其余的則游離于酸乳中[21]。其中Shankar等[22]報(bào)道了嗜熱鏈球菌生長需要的氨基酸主要是谷氨酸、組氨酸和甲硫氨酸。

表 6 17種游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)Table 6 Standard curve equations and correlation coefficients of 17 free amino acid standards

表 7 不同菌種發(fā)酵酸乳中的游離氨基酸含量Table 7 Contents of free amino acid in fermented yogurt from different strains

由表7可知，在實(shí)驗(yàn)酸奶樣品中， 游離氨基酸的總量在58.39～254.41mg/L之間，人體必需氨基酸的含量占游離氨基酸總量的10.47%～24.58%。4種酸乳樣品中谷氨酸含量明顯高于其他游離氨基酸。與普通酸乳相比，添加益生菌的發(fā)酵酸乳其總游離氨基酸含量均有所增加，其中添加干酪乳桿菌的發(fā)酵酸乳增加較顯著(P＜0.05)。游離氨基酸的增加主要是由于發(fā)酵劑形成的肽酶作用的結(jié)果，肽酶積累導(dǎo)致游離氨基酸數(shù)量的增加[23]。

圖 3 不同菌種發(fā)酵酸乳中的游離氨基酸含量色譜圖Fig. 3 Chromatograms of free amino acids in fermented yogurt from different strains

由表7、圖3可知，與乳酸菌發(fā)酵酸乳相比，添加益生菌的發(fā)酵酸乳中，大部分氨基酸含量呈上升趨勢，但變化的顯著性不同。Ser、Asp、Glu、Pro、Cys、Lys、Tyr、Met、Leu及Phe含量有顯著差異(P＜0.05)。這可能要?dú)w因于益生菌與乳酸菌之間的相互作用，球菌在生長過程中產(chǎn)生的甲酸和二氧化碳對(duì)桿菌的生長有促進(jìn)作用，桿菌在生長過程中產(chǎn)生的一些肽和自由氨基酸是球菌和自身的促生長因子[24-25]。

3 結(jié) 論

馬嵬等[26]采用SDS-PAGE電泳法和反相高效液相色譜法測定了5種原味發(fā)酵型酸奶中乳清蛋白的組成和游離氨基酸含量，為全面了解酸乳的組成特性提供了依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)以響應(yīng)面優(yōu)化后的最優(yōu)生產(chǎn)工藝條件為基礎(chǔ)制備益生菌發(fā)酵酸乳，并將其與傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵酸乳相比，發(fā)現(xiàn)益生菌發(fā)酵酸乳中αs2-酪蛋白、αs1-酪蛋白和β-乳球蛋白條帶比較淺，其中添加植物乳桿菌的發(fā)酵酸乳所形成的條帶最淺；而pH4.6可溶性氮、氨基氮和游離氨基酸的含量均有所增加，其中添加干酪乳桿菌的發(fā)酵酸乳增加顯著。與乳酸菌發(fā)酵酸乳相比，其多肽的種類并沒有增加，只是部分多肽含量發(fā)生了一些變化；且益生菌發(fā)酵酸乳中大部分氨基酸含量呈上升趨勢，但變化的顯著性不同。產(chǎn)生這些變化的原因是由于益生菌本身所含有的酶類降解蛋白造成的，且由于益生菌與乳酸菌之間的相互作用造成不同益生菌在酸乳發(fā)酵過程中代謝活性的不同，而導(dǎo)致對(duì)蛋白的降解程度不同。

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